《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》：Combining biosensor and metabolic network optimization strategies for enhanced l -threonine production in Escherichia coli
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时间：2025年03月27日来源：Biotechnology for Biofuels and Bioproducts 6.1
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为解决 L - 苏氨酸生产菌株产量和效率的问题，江南大学等研究人员开展了结合生物传感器和代谢网络优化策略提升大肠杆菌 L - 苏氨酸产量的研究。最终获得 THRM13 菌株，在 5 L 生物反应器中 L - 苏氨酸产量达 163.2 g/L，为 L - 苏氨酸生产提供新策略。
在现代生物产业的发展浪潮中，L - 苏氨酸作为哺乳动物必需的营养物质，在动物饲料、食品、医药等领域有着广泛应用。尤其是在动物饲料方面，它能促进动物生长、降低养殖成本，市场需求持续增长。然而，目前 L - 苏氨酸的生产面临诸多挑战。虽然大肠杆菌生产 L - 苏氨酸的产量已能达到一定水平，但与 L - 赖氨酸和 L - 谷氨酸相比仍有差距。而且，部分高产量菌株存在低产率的问题，无法满足工业生产的成本效益需求。同时，复杂代谢网络的限制，使得有效工程靶点难以快速确定，严重阻碍了 L - 苏氨酸产量的提升。
为了突破这些瓶颈，江南大学、北京联合大学等研究机构的研究人员开展了深入研究。他们旨在开发出符合工业生产标准的 L - 苏氨酸工程菌株，通过一系列创新策略，提高 L - 苏氨酸的产量和生产效率。该研究成果发表在《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》上。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：一是转录组学分析，用于筛选能感知外源 L - 苏氨酸的启动子以及分析不同菌株的基因表达差异；二是构建荧光报告系统，通过将 CysB 突变体与增强型绿色荧光蛋白（eGFP）结合，构建对 L - 苏氨酸浓度变化敏感的荧光报告系统；三是多组学分析结合计算机模拟，利用多组学技术挖掘潜在的遗传因素，借助计算机模拟优化代谢通量，预测基因敲除靶点。
筛选响应 L - 苏氨酸水平变化的内源性遗传元件：研究人员对外源添加不同浓度 L - 苏氨酸的大肠杆菌 MG1655 进行转录组学分析，初步筛选出 32 个与 L - 苏氨酸浓度正相关的基因。进一步对其中 21 个基因的启动子进行筛选和表征，发现PcysD?、PcysJ?、PcysP?和PcysK?与 L - 苏氨酸浓度呈线性正相关，其中PcysK?启动子响应性能最佳，但天然遗传元件的荧光阈值范围窄，易导致筛选过程出现高假阳性率。
改造天然传感器以提高对 L - 苏氨酸的响应：通过序列分析发现 “cys” 启动子上游存在 CysB 蛋白结合位点，删除该位点后，启动子失去对 L - 苏氨酸的响应。随后构建了过表达 CysB 的生物传感器 pSensor，其在 0 - 4 g/L L - 苏氨酸浓度范围内呈线性荧光响应，荧光阈值较PcysK? - egfp 提高约 2.1 倍。对 CysB 蛋白进行分子对接和定点突变，得到 pSensorThr 突变体，其响应阈值比 pSensor 提高约 2.4 倍，且能有效检测内源性 L - 苏氨酸合成。与现有 L - 苏氨酸生物传感器相比，pSensorThr 荧光响应阈值更高，但浓度响应范围有待进一步优化。
辅助高通量筛选鉴定 L - 苏氨酸高产菌株：利用温度敏感型MP6ts质粒构建 THR36-L19 菌株的突变文库，将 pSensorThr 生物传感器引入突变文库，通过荧光激活细胞分选（FACS）和 Qpix 筛选系统进行两轮高通量筛选。经过五轮筛选，获得 50 个突变菌株，其中 THRM1 菌株在摇瓶培养中 L - 苏氨酸积累量达 38.97 g/L。
多组学指导的反向代谢工程进一步提高 L - 苏氨酸产量：对 THRM1 菌株进行多组学分析，基因组测序发现多个突变位点，将部分突变位点整合到亲本菌株 THR36-L19 中验证其对 L - 苏氨酸合成的影响。转录组学分析表明，THRM1 菌株中参与糖酵解途径（EMP）和乙醛酸旁路的基因上调，三羧酸循环（TCA）的大部分基因下调。通过基因敲除实验进一步优化菌株，得到 THRM6 菌株，L - 苏氨酸产量达 41.36 g/L 。
通过计算机模拟优化代谢通量最大化 L - 苏氨酸产量：基于大肠杆菌 iML1515 基因组规模代谢模型（GSMN）进行代谢工程优化，引入PYCRe?酶反应方程，设置部分基因反应通量为 0 模拟基因敲除。计算机模拟发现谷氨酸脱氢酶（GdhA）表达对 L - 苏氨酸合成至关重要，通过构建 gdhA 基因的核糖体结合位点（RBS）文库，筛选出合适的Ptrc??RBS组合，得到 THRM7 菌株，L - 苏氨酸产量达 44.12 g/L。进一步预测并敲除 5 个基因，获得 THRM13 菌株，在 5 L 生物反应器中进行分批补料发酵，L - 苏氨酸产量达 163.2 g/L，产率为 0.603 g/g 葡萄糖，这是目前报道的大肠杆菌中 L - 苏氨酸的最高产量。
研究结论与讨论部分指出，本研究成功开发了一种高灵敏度、高荧光阈值的生物传感器，辅助高通量平台筛选出优良突变体。通过多组学分析指导的反向代谢工程和计算机模拟，优化了细胞代谢流分布，显著提高了 L - 苏氨酸产量。THRM13 菌株在不使用外源诱导剂和抗生素的情况下达到了目前最高的 L - 苏氨酸产量，为 L - 苏氨酸的工业化生产提供了极具潜力的菌株和创新策略。同时，该高通量筛选策略可用于后续菌株的迭代进化，为其他化学品的高产菌株开发提供了重要参考，推动了微生物细胞工厂在生物制造领域的发展。
