一种基于流式细胞术的单细胞多参数分析：从增殖到线粒体膜电位及细胞死亡的综合探究

《Cell Death Discovery》：Comprehensive analysis of cellular metrics: From proliferation to mitochondrial membrane potential and cell death in a single sample

为探究细胞数量变化机制，研究人员开展多参数流式细胞术研究，揭示细胞增殖、死亡等过程，助力医学研究。

　　

多参数流式细胞术：解锁细胞生命奥秘的新钥匙

在细胞的微观世界里，细胞数量的变化犹如一场神秘的舞蹈，背后隐藏着诸多复杂的机制。在体外实验和药物筛选中，细胞数量的增减主要取决于细胞死亡和增殖这两个关键因素。理解这些过程的生物学机制，对于揭示药物或基因治疗的作用方式至关重要，无论是在基础研究领域，还是在临床前试验阶段，都犹如一把关键的钥匙，能开启深入探究疾病治疗的大门。

然而，以往的研究方法存在一定的局限性。传统的荧光和共聚焦显微镜技术，不仅容易受到背景信号波动的干扰，而且在选择显微镜载玻片上的特定区域进行分析时，不可避免地会产生偏差。与之相比，流式细胞术虽具有独特优势，但如何利用它全面、系统地分析影响细胞数量变化的多个关键参数，一直是科研人员努力探索的方向。

为了攻克这些难题，来自喀山联邦大学（Kazan Federal University）等机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Cell Death Discovery》杂志上，为该领域带来了新的曙光。

研究人员整合并优化了多种基于流式细胞术的染色技术，如溴脱氧尿苷（BrdU）、碘化丙啶（PI）、膜联蛋白 V（Annexin V）、JC-1 和 CellTrace Violet 等，将其纳入一个统一的实验方案，实现了从单个样本中快速获取多达八个不同参数的目标。这一创新的实验方案，大大提高了研究效率和数据的全面性。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。其中，流式细胞术是核心技术，它能够同时检测细胞的大小、粒度以及不同染色剂和结合抗体发出的荧光信号，实现对细胞多种特性的量化分析。通过 BrdU/PI 染色，可监测细胞周期进展和增殖情况；Annexin V/PI 染色用于区分凋亡、活细胞和死细胞；JC-1 染色评估线粒体膜电位；CellTrace Violet 染色则能追踪细胞增殖和世代。此外，研究人员还利用了细胞计数技术，通过时间依赖性的流式细胞术获取细胞数量信息123。

接下来，让我们看看研究的具体结果：

1. 细胞增殖和细胞计数：通过 CellTrace Violet 染色和模板 2，研究人员评估了不同细胞系的增殖率。结果显示，SW480 细胞在 200 nM 鱼藤酮（rotenone）处理 72 小时后，相对增殖率显著下降，而 200 nM 抗霉素 A（antimycin A）处理后下降更明显，表明 SW480 细胞对抗霉素 A 更为敏感。COLO-320 细胞系初始增殖率高于 SW480 细胞，但在鱼藤酮和抗霉素 A 处理后，增殖率也大幅下降。在胶质瘤细胞系中，LN428 细胞经 20 μM 替莫唑胺（temozolomide）处理后，相对增殖率从 10.73 显著降至 4.26，而 D247MG 细胞系对替莫唑胺和卡莫司汀（carmustine）的增殖率变化不明显。同时，流式细胞术计数发现，细胞数量的变化与增殖率的变化趋势一致456。
2. 细胞周期分析：利用 BrdU/PI 染色和模板 3 对细胞周期进行分析。在 SW480 细胞系中，抗霉素 A 处理导致 G₁期细胞比例显著降低，大量细胞进入 S 期；COLO-320 细胞系在抗霉素 A 处理后，G₁和 G₂期细胞百分比下降，S 期细胞比例增加。在胶质瘤细胞系中，D247MG 细胞系经替莫唑胺或卡莫司汀处理后，细胞周期动力学无明显变化；而 LN428 细胞系经替莫唑胺处理后，G₁期细胞百分比急剧下降7。
3. 凋亡和死细胞定量：借助 Annexin V/PI 染色和模板 2 对凋亡和死细胞进行定量。SW480 细胞系经鱼藤酮和抗霉素 A 处理 72 小时后，死细胞和凋亡细胞数量无显著增加；COLO-320 细胞系这些细胞数量增加。在胶质瘤细胞系中，替莫唑胺使 LN428 和 D247MG 细胞系的死细胞数量显著增加，卡莫司汀仅使 D247MG 细胞系死细胞数量增加，且 D247MG 细胞经两种药物处理后未发生凋亡89。
4. 线粒体膜电位评估：通过 JC-1 染色和模板 1 分析线粒体膜电位（MMP）。CRC 细胞系中，SW480 细胞大部分（85%）具有高 MMP，COLO-320 细胞主要表现为低 MMP。鱼藤酮处理使两种 CRC 细胞系 MMP 下降，抗霉素 A 对 COLO-320 细胞系 MMP 影响显著。胶质瘤细胞系中，LN428 和 D247MG 细胞主要呈现高 MMP，卡莫司汀处理使 D247MG 细胞系 MMP 显著降低10。

综合上述研究结果，该研究提出的多参数流式细胞术分析方法，能够全面、深入地探究细胞增殖、死亡、细胞周期、凋亡以及线粒体膜电位等多个关键参数之间的关系。这种方法不仅可以明确细胞数量变化是由增殖减少还是死亡增加引起的，还能揭示线粒体去极化、凋亡以及细胞周期变化在其中的作用机制。此外，研究人员通过气泡图可视化技术，更直观地展示了不同处理对细胞的综合影响，为进一步理解细胞对药物的反应提供了有力工具。

这一研究成果在生命科学和医学领域具有重要意义。它为基础研究提供了一种强大的实验方法，有助于深入剖析细胞生命过程的奥秘；在临床前试验中，能够更准确地评估药物或基因治疗的效果，为开发更有效的治疗策略提供依据。相信随着该技术的不断完善和应用，将为生命科学和健康医学领域的发展带来更多的突破和惊喜。