青蛙源合成肽：对抗革兰氏阴性病原体的新型抗菌候选物

《TRENDS IN Biotechnology》：Frog-derived synthetic peptides display anti-infective activity against Gram-negative pathogens

　　

在全球范围内，细菌对抗生素的耐药性问题日益严峻，这已然成为一个重大的公共卫生挑战。每年，仅在美国，抗菌药物耐药感染就导致超过 280 万例病例、近 35000 人死亡，医疗费用超过 40 亿美元。同时，大多数现有抗生素属于广谱抗生素，在杀死病原体的同时，也会对宿主细胞和有益微生物群产生不良影响，破坏人体的微生态平衡。因此，研发新型抗菌药物迫在眉睫，这些药物需要能够选择性地消除病原体，同时又不会诱导细菌产生耐药性（AMR）。

两栖动物是新型抗菌化合物的潜在丰富来源。它们生活在水生和湿地环境中，经常接触各种病原体，为了抵御这些威胁，其颗粒腺会分泌多种具有抗菌特性的物质，其中抗菌肽（AMPs）是关键的防御机制之一。AMPs 具有多种作用机制，不仅能直接杀菌，还能调节宿主免疫反应，而且不易诱导细菌产生耐药性。

在此背景下，宾夕法尼亚大学的研究人员展开了一项关于青蛙源合成肽的研究，相关成果发表在《TRENDS IN Biotechnology》上。

研究人员运用了多种关键技术方法。首先是基于丙氨酸扫描诱变（Ala-scanning mutagenesis）的结构 - 活性关系（SAR）研究，通过对合成肽进行单个丙氨酸替换，来评估每个氨基酸在肽结构、理化性质和抗菌活性中的作用。其次，使用圆二色谱（CD）光谱技术测定肽的二级结构倾向，在不同溶剂条件下分析肽的结构变化。此外，通过最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）测定来评估肽的抗菌活性，还进行了细菌耐药性进化实验、作用机制研究、共培养实验以及细胞毒性和体内抗菌活性测试等。

研究结果如下：

• 设计和结构 - 功能导向的合成肽探索：研究人员以 Andersonin-D1 为基础，设计了 dF-AndD1，并通过 Ala 扫描诱变研究其抗菌活性的决定因素。结果发现，dF-AndD1 对大多数革兰氏阴性病原体有抗菌活性，对革兰氏阳性细菌活性较差或无活性，显示出窄谱抗菌特性。同时，肽的疏水性和净电荷与抗菌活性密切相关，C 末端区域在抗菌功能中起关键作用。

• 结构 - 功能导向的优化第二代合成肽设计：基于 Ala 替换分析，研究人员设计了第二代 dF-AndD1 衍生物，如L3-dF-AndD1、K13-dF-AndD1 等。这些新肽的抗菌活性相比 dF-AndD1 有所增强，进一步证实了疏水性和净电荷是关键的理化决定因素。其中，L3-dF-AndD1 和K13-dF-AndD1 表现出较强且一致的抗菌活性，对革兰氏阴性病原体具有选择性，对金黄色葡萄球菌无活性。

• 细菌耐药性进化和作用机制研究：研究人员测试了大肠杆菌对合成肽的耐药性发展，发现经过 30 天的实验，大肠杆菌对测试的 AMPs（包括 dF-AndD1 和先导化合物）均未产生耐药性，而对环丙沙星产生了耐药性。在作用机制方面，通过多种荧光和紫外 - 可见探针研究发现，合成肽能够有效透化细菌外膜、使细胞质膜去极化，但在细胞质膜透化方面存在差异，如K13-dF-AndD1 无法透化大肠杆菌 DH5α-pUC19 的细胞质膜。

• 合成肽在共培养实验中对革兰氏阴性病原体的特异性研究：在由金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌组成的共培养模型中，L3-dF-AndD1 能够选择性地杀死革兰氏阴性细菌，对金黄色葡萄球菌无影响，而 dF-AndD1 仅对鲍曼不动杆菌有抗菌作用，且在高浓度下会导致铜绿假单胞菌过度生长。

• 脱靶效应研究：测试合成肽对 11 种肠道共生菌的抗菌活性，发现 dF-AndD1 及其大多数类似物对肠道共生菌的活性较差或无活性，表明其对人体肠道微生物组的毒性较低。同时，对两种先导化合物L3-dF-AndD1 和K13-dF-AndD1 进行细胞毒性测试，结果显示在测试浓度范围内对角质形成细胞和人胚肾细胞无毒性。

• 合成肽在临床前动物模型中的抗感染活性研究：在皮肤感染和大腿感染的小鼠模型中，L3-dF-AndD1 和K13-dF-AndD1 表现出良好的体内抗菌活性，能够显著降低细菌载量，且无明显毒性。其中，L3-dF-AndD1 在大腿感染模型中甚至能够完全清除鲍曼不动杆菌感染。

研究结论和讨论部分指出，AMPs 作为治疗 AMR 感染的有前景的替代方案，在本研究中，dF-AndD1 及其衍生物展现出了诸多优势。这些合成肽通过理性设计，基于对其结构和理化性质的研究，成功优化了抗菌活性。它们具有窄谱抗菌特性，能够选择性地靶向革兰氏阴性病原体，同时对人体细胞和肠道共生菌无明显毒性。在体内实验中，先导肽L3-dF-AndD1 和K13-dF-AndD1 显著降低了细菌载量，且未观察到毒性，为开发安全有效的抗生素候选物提供了有力的支持。然而，目前仍有许多问题有待进一步研究，例如 AMPs 的革兰氏特异性的确切结构和理化性质、细菌膜组成对肽抗菌活性的影响、肽的具体作用机制、是否会诱导其他革兰氏阴性病原体产生耐药性、最佳给药途径以及药代动力学和药效学特征等。这些研究将为未来开发更有效的抗菌疗法提供重要的参考，有望推动新型抗生素的发展，应对全球范围内的细菌耐药性危机。