大肠杆菌厌氧发酵底物分解代谢的奥秘：核糖体、蛋白质组与生长调控

《Microbial Cell Factories》：The catabolic nature of fermentative substrates influences proteomic rewiring in Escherichia coli under anoxic growth

为探究大肠杆菌在厌氧发酵底物时的生理变化，研究人员开展了底物对蛋白质组重编程影响的研究，发现底物性质影响生长，对优化工业厌氧转化有意义。

　　

大肠杆菌厌氧发酵底物分解代谢研究解读

在微观的微生物世界里，大肠杆菌（Escherichia coli）作为一种常见的模式生物，其生长代谢过程一直是科学家们关注的焦点。在厌氧发酵的环境中，大肠杆菌的生长面临诸多挑战。以往研究表明，在厌氧分批发酵底物时，大肠杆菌细胞增殖速率下降，并且细胞需要消耗大量的蛋白质组来满足其在缺氧环境下的分解代谢和合成代谢需求。对于快速增殖的细胞，大肠杆菌的生长速率与细胞核糖体含量之间存在直接关系。然而，在底物厌氧发酵分解代谢过程中，细胞资源如何重新分配，特别是核糖体在其中扮演怎样的角色，仍是一个未解之谜。这不仅关乎对大肠杆菌生理机制的深入理解，也对优化工业厌氧发酵过程意义重大。

为了揭开这些谜团，印度理工学院孟买分校的研究人员展开了一项深入研究。他们将实验结果与系统的粗粒度蛋白质组分配模型相结合，以探究在不同糖酵解和非糖酵解底物的厌氧发酵分解代谢过程中，大肠杆菌在缓慢生长速率下的生理变化。该研究成果发表在《Microbial Cell Factories》杂志上。

在研究方法上，研究人员主要采用了以下关键技术：

1. 厌氧分批发酵：使用大肠杆菌 K - 12 菌株 BW25113 对不同底物进行厌氧发酵，在特定的 M9 基本培养基中培养，严格控制温度、转速、pH 值和厌氧条件，添加不同底物并确保碳含量相同，通过测量细胞密度来确定细菌生长速率。
2. 总 RNA 和总蛋白质的测定：分别利用 TRIzol 法和 Biuret 法对总 RNA 和总蛋白质进行定量测定，以获取细胞内 RNA 和蛋白质的含量信息。
3. 基因组规模代谢模型（GEM）和约束分配通量平衡分析（CAFBA）：借助修改后的大肠杆菌 MG1655 的基因组规模代谢模型 iJO1366，结合 CAFBA 方法，将大肠杆菌蛋白质组资源系统地分配到不同的粗粒度功能部门，如核糖体、分解代谢、代谢和管家部门。

研究结果如下：

1. 核糖体丰度与蛋白质含量的关系：在不同底物的厌氧发酵过程中，核糖体丰度没有显著差异，但细胞总蛋白质含量却因底物不同而显著变化（除葡萄糖和果糖外）。研究发现，在较低的细胞增殖速率下，主动翻译的核糖体比例下降，导致细胞蛋白质含量减少。通过理论计算得出核糖体翻译延伸率，它会随着生长速率的增加而增加，以维持细胞在营养有限的厌氧生长条件下的蛋白质需求。这表明细胞的生理结果是活性细胞核糖体含量和翻译延伸率相互作用的结果，最终影响了细菌细胞的增殖速率。
2. 核糖体蛋白质组比例对细胞增殖的影响：虽然在六种底物代谢过程中，总核糖体蛋白质组份额相似，但活性核糖体蛋白质组在葡萄糖分解代谢时占比最高，而在木糖、山梨醇和丙酮酸分解代谢时，非活性核糖体蛋白质组份额增加，导致生长迟缓。核糖体蛋白质合成时间与细胞倍增时间相关，合成时间越长，细菌生长速率越慢。此外，研究还观察到非活性核糖体丰度及其蛋白质组份额对细菌生长速率有负面影响。同时，研究发现活性与非活性核糖体蛋白质组比例对细菌生长速率有直接影响，这一结论在大肠杆菌细胞的慢到中等生长范围内（生长速率 < 0.8 h^-1）得到了验证。
3. 底物摄取机制与分解代谢部门蛋白质组成本的关系：根据底物的不同摄取机制和分解代谢情况，研究人员计算了每种底物流入时的蛋白质组成本。结果显示，丙酮酸的摄取阻碍最小，但因其非糖酵解分解代谢无法达到最佳性能，导致增殖速率较慢。葡萄糖和葡萄糖酸的内化速率相似，但代谢途径不同导致生长速率存在差异。木糖的流入成本相对较低，但能量密集型的底物转化影响了细菌增殖。果糖的相关成本较高，但其能支持较好的厌氧细菌生长速率。山梨醇的流入对大肠杆菌来说耗能巨大，导致细菌生长速率最低。由此可见，理论计算的分解代谢相关蛋白质组成本受到底物摄取速率、代谢途径和细胞增殖速率等多种因素的影响。
4. 底物性质对大肠杆菌蛋白质组粗粒度分配的影响：通过将蛋白质组分配到四个功能部门，研究发现底物的性质会影响蛋白质组的分配。丙酮酸的流入速率最高，其相应的分解代谢部门蛋白质组占总细胞蛋白质组的约 12%。葡萄糖和葡萄糖酸的内化速率相似，但摄取机制的差异导致分解代谢蛋白质组成本不同，葡萄糖酸的摄取分配了略高的蛋白质组（约 9%）。木糖内化分配了约 15% 的蛋白质组，果糖则高达约 23%，山梨醇的分解代谢蛋白质组份额最高，约为 29%。大量蛋白质组用于底物摄取会减少用于细胞生物合成的蛋白质组，山梨醇代谢的生物合成蛋白质组份额最小（约 15%），而葡萄糖（约 37%）和葡萄糖酸（约 34%）的生物合成蛋白质组较高，支持了较高的细胞增殖速率。
5. 不同粗粒度部门蛋白质含量与生理参数的相关性：管家蛋白质组在细胞蛋白质组资源中占固定比例（0.45），但与细胞生长速率呈线性相关，同时也与细胞生物质产量相关，这表明底物流入和分解代谢在决定表型结果中起着重要作用。活性核糖体蛋白质组丰度与细菌增殖速率和生物质产量呈正相关，而非活性核糖体蛋白质组则相反。底物流入速率与相应的分解代谢蛋白质组丰度呈负相关，即底物摄取速率越高，用于运输和内化的蛋白质组支出越低。代谢部门的生物合成蛋白质与底物流入速率和碳流入速率呈正相关，较低的底物流入速率会减缓细胞代谢活动，影响细胞生理。

在结论和讨论部分，研究表明大肠杆菌在不同糖酵解和非糖酵解底物的缺氧分解代谢过程中会产生不同的表型变化。底物的性质影响了宿主新陈代谢与蛋白质组分配之间的关键联系，进而产生不同的表型。底物摄取、活性核糖体丰度和翻译速率、蛋白质组分配等限速步骤决定了营养有限缺氧条件下细胞的特定生长速率。这一研究成果加深了人们对大肠杆菌在有限资源下适应厌氧发酵生长的理解，有助于探索微生物代谢调控和细胞资源的有效管理，为可持续生物加工提供理论基础。未来研究可以在此基础上进一步探索核糖体分析、代谢组学和蛋白质组学研究，以更深入地了解关键代谢反应和蛋白质组成本对细菌生理学的影响，有望为生物转化和获得理想表型提供更好的控制方法，降低产品驱动的生物转化成本。