综述：用于抗羽毛污染物蛋白质工程的热稳定角蛋白酶研究进展

《Applied Microbiology and Biotechnology》：An update on thermostable keratinases for protein engineering against feather pollutants

该综述聚焦热稳定角蛋白酶，探讨其降解羽毛污染物及在多领域应用，极具价值。

　　

引言

全球家禽业每年产生大量羽毛废弃物，约 85 亿吨，印度每年就有约 3.5 亿吨。羽毛主要成分角蛋白含大量二硫键，使其难以降解，在垃圾填埋场长期积累，污染土壤和水，传播多种疾病。传统处理方法，如焚烧、填埋或化学分解，存在诸多弊端，如破坏氨基酸、污染环境、产生劣质羽毛粉、导致硝酸盐渗漏等。

微生物角蛋白水解是一种可行的解决方案，能防止营养物质破坏和减少环境污染。已发现多种羽毛降解微生物，包括细菌、放线菌和真菌，但细菌角蛋白酶因效率高、稳定性强、适用范围广等优势，成为工业和研究的重点。

降解羽毛的微生物概述

能降解羽毛角蛋白的微生物种类多样，细菌中芽孢杆菌属最为常见，如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）等。部分芽孢杆菌属细菌，如地衣芽孢杆菌 PWD - 1、嗜热脂肪芽孢杆菌 MG104 等，属于中度嗜热需氧菌，能在 50 - 60°C 环境中生长。此外，还有从热火山地区分离出的超嗜热和耐热角蛋白降解细菌，如费氏杆菌（Fervidobacterium pennivorans）、海岛热杆菌（Fervidobacterium islandicum AW - 1）等。

放线菌中，链霉菌属（Streptomyces）的多种菌种，如链霉菌 albidoflavus、S. fradiae 等，能产生角蛋白酶。海洋生态系统来源的放线菌也有角蛋白降解能力。

真菌中，包括金孢霉属（Chrysosporium）、曲霉属（Aspergillus）等多种真菌可降解角蛋白。例如，黑曲霉（Aspergillus niger）因高蛋白酶活性，在羽毛废物处理方面有很大潜力。

尽管角蛋白降解微生物种类丰富，但细菌角蛋白酶在工业应用中更具优势，因其降解效率高、酶的分离纯化相对容易，且培养和生长条件更易控制。

羽毛降解机制

羽毛降解主要受角蛋白顽固特性阻碍，其降解过程复杂，目前仍存在诸多未知。一般来说，细菌角蛋白酶通过一系列协同酶促反应，将角蛋白复杂结构分解为较小片段。

首先，羽毛降解细菌中的一些未知还原酶会还原角蛋白中的二硫键。二硫键还原酶或还原剂可催化该反应，使角蛋白分解为部分切割的蛋白质，释放巯基，改变角蛋白 β - 折叠中氨基酸构象，为角蛋白酶提供水解位点。

其次，二硫键还原后，羽毛可被多种外肽酶水解，如 S8 外肽酶，它能水解肽键，产生多个肽片段。β - 天冬氨酰肽酶则选择性作用于角蛋白结构中靠近异天冬氨酸残基的肽键，促进角蛋白水解。

最后，产生的肽片段可被转运到细菌内或在细胞外进一步被内肽酶（如 M32 羧肽酶）或外肽酶分解，释放出氨基酸，这是角蛋白水解的最终产物。此外，氨基酸的脱氨作用还会释放铵离子，是动物饲料和肥料的重要成分。

热稳定性：羽毛降解的关键特性

酶的最佳反应温度取决于产生该酶的生物的生长条件。嗜热菌来源的酶能在较高温度下发挥作用，如 60 - 80°C。

在羽毛降解过程中，温度起着关键作用。高温可增加分子动能，破坏角蛋白的非共价相互作用，促进二硫键断裂，克服角蛋白复杂结构中的稳定相互作用，使蛋白质构象解体。同时，蛋白质在高温下还可能发生脱酰胺和琥珀酰亚胺形成等降解反应。

例如，嗜温菌产生的角蛋白酶活性较低，而嗜热菌来源的角蛋白酶，如芽孢杆菌属 NFH5 和 Actinomadura keratinilytica Cpt29 产生的角蛋白酶，活性显著更高。热稳定角蛋白酶在极端工业环境（高温、pH 波动）下能有效发挥作用，降低温度调控成本，简化工业流程。如热稳定角蛋白酶 DgeKer，在 70°C 时活性最高，能高效降解角蛋白，且半衰期长，适合连续羽毛降解发酵过程。

热稳定角蛋白酶的生化特性

细菌热稳定角蛋白酶具有多种生化特性，包括在极端条件下的稳定性、底物特异性和催化效率等。这些特性受温度、pH、金属离子和抑制剂等因素影响，使其适用于多种工业和生物技术领域。

热稳定性是其重要特性之一，如蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）L10 产生的角蛋白酶在 30 - 80°C 范围内稳定，100°C 时仍能保持 97.66% 的活性。许多热稳定角蛋白酶在碱性环境下具有较高活性，如枯草芽孢杆菌 NRC3 产生的角蛋白酶在 pH 5 - 10 范围内稳定性增强。

部分热稳定角蛋白酶能水解多种角蛋白底物，如普通高温放线菌（Thermoactinomyces vulgaris）TK1 - 21 产生的角蛋白酶可降解鸡毛、猪鬃和猪蹄。酶的动力学参数，如Km?和Vmax?，可反映其催化效率，如高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）RBDV1 产生的角蛋白酶Km?为 1.42 μM，Vmax?为 1.673 μM/min，催化能力较强。

此外，某些金属离子可增强角蛋白酶活性，如枯草芽孢杆菌 NRC3 角蛋白酶在Na+、K+、Mg2+、Ba2+和Ca2+等金属离子存在时活性增强；而某些离子或化合物则会抑制角蛋白酶活性，如芽孢杆菌属 CSK2 产生的角蛋白酶在Al3+和Fe3+存在时受到抑制，在 2 - 巯基乙醇等还原剂存在时活性增强。

热稳定角蛋白酶的结构特征

1. MtaKer - 台湾温泉栖热菌 WR - 220：台湾温泉栖热菌（Meiothermus taiwanensis）WR - 220 是一种能在 65°C 高效降解羽毛的细菌，其分泌的 MtaKer 是一种 41.3 kDa 的细胞外单体丝氨酸蛋白酶（S8 家族）。rMtaKer 在 25 - 75°C 和 pH 4 - 11 范围内均有活性，最适温度为 65°C，最适 pH 为 10。

MtaKer 由信号肽、N - 末端前肽和成熟蛋白酶组成。成熟 rMtaKer 单体包含 16 个 β - 折叠和 8 个 α - 螺旋，其核心由 7 个平行 β - 折叠和 6 个 α - 螺旋构成，含有保守催化三联体 Asp39、His72 和 Ser224，对肽键裂解至关重要。此外，rMtaKer 还含有两个钙离子和两个分子内二硫键，钙离子对蛋白质折叠和结构完整性起关键作用，二硫键则参与热稳定性和底物识别。

rMtaKer 的 C - 末端残基与相邻单体的活性位点相互作用，使底物环转化为反平行 β - 折叠，增强底物与酶的结合，促进蛋白水解。

2. Fervidolysin - 费氏杆菌：费氏杆菌（Fervidobacterium pennivorans）是一种极端嗜热菌，能在 70°C、pH 6.5 的环境下降解羽毛。Fervidolysin 是其产生的一种热稳定角蛋白酶，与 MtaKer 类似，它含有信号肽、前肽结构域和催化区域，还包含两个特殊的 β - 三明治结构域（SD1 和 SD2）。

Fervidolysin 呈细长结构，N - 末端前肽结构域（PD）呈球状，通过疏水和氢键相互作用稳定。PD 结构域与 SD2 结构域相互作用，C - 末端与催化结构域相连。催化结构域具有类似枯草杆菌蛋白酶的折叠结构，包含催化三联体 Ser389、His208（该结构中突变为 Ala）和 Asp170，以及独特的插入序列和钙结合位点，对酶的结构和功能至关重要。

Fervidolysin 的 S1 和 S2 底物结合口袋由特定氨基酸残基构成，有助于底物结合和水解。两个 β - 三明治结构域与其他结构域相互作用，增强酶的整体结构稳定性和功能。

3. FiBAP（β - 天冬氨酰肽酶） - 海岛热杆菌 AW - 1：海岛热杆菌（Fervidobacterium islandicum）AW - 1 是一种极端嗜热厌氧细菌，能产生多种蛋白水解酶，其中 FiBAP 是一种热稳定的 β - 天冬氨酰肽酶，在饥饿时表达上调，有助于细菌在应激条件下生存，对降解角蛋白至关重要。

FiBAP 是一种 318 kDa 的八聚体金属肽酶，在 80°C、pH 7.0 时酶活性最高。Zn2+可增强其活性，1% SDS 和 1 mM EDTA 则抑制其活性。

FiBAP 晶体结构为八聚体，由四聚体二聚体组成。其热稳定性受分子亚基间相互作用影响，每个二聚体中额外的三个盐桥共形成 12 个离子相互作用，增强了酶的热稳定性。

FiBAP 单体由 N - 末端 β - 三明治结构域和 C - 末端催化结构域组成。β - 三明治结构域由九层 β - 折叠组成，为整体结构提供稳定性。催化结构域采用(β/α)8?三磷酸甘油醛异构酶（TIM） - 桶状结构，包含八个 β - 折叠和九个 α - 螺旋，中心核心区域为底物结合位点，由两个Zn2+离子构成双核锌中心。

当与底物类似物结合时，FiBAP 的 Pro290 - Leu302 环会转化为两个稳定的反平行 β - 折叠，该环靠近底物结合位点，可能参与调节底物进入和产物排出。

4. FisCP（M32 羧肽酶） - 海岛热杆菌 AW - 1：FisCP 是海岛热杆菌 AW - 1 中由 FIAW1_1600 基因编码的金属依赖性蛋白酶，属于 M32 羧肽酶家族，能在 80°C、中性 pH 条件下降解羽毛。

FisCP 晶体结构主要为螺旋形式，活性位点附近有一个三链 β - 折叠。其寡聚化和结构折叠对酶的功能至关重要，通过疏水相互作用、盐桥和氢键维持寡聚状态，增强热稳定性。

FisCP 的活性位点位于底物结合凹槽内，包含 M32 羧肽酶特征性的 HEXXH 基序和Co2+结合位点，Co2+由 His253、His257 和 Glu283 配位，对酶的稳定性和活性至关重要。底物通过凹槽进入活性位点，其 C - 末端羧酸盐基团与 FisCP 的 Arg335 和 Tyr407 配位，在活性位点发生酸碱反应，促进肽键裂解。

5. FiSufS - SufU - 海岛热杆菌 AW - 1：海岛热杆菌 AW - 1 拥有一套完整的 Suf 系统（SufCBDSU），在缺乏元素硫的羽毛培养基中培养时，该系统显著上调。FiSufS 和 FiSufU 蛋白通过半胱氨酸和胱氨酸的循环，协同发挥硫转移活性，维持细胞内氧化还原平衡，促进羽毛角蛋白的分解。

FiSufS 是一种同源二聚体蛋白，分子量为 94 kDa，晶体结构包含 14 个 α - 螺旋和 12 个 β - 折叠，活性位点由与辅因子吡哆醛磷酸（PLP）共价结合的 Lys232 和参与硫转移的过硫化 Cys372 - SH 组成。

FiSufU 是一种 15.5 kDa 的单体蛋白，包含 6 个 α - 螺旋和 3 个 β - 折叠，活性位点有一个由 Asp36、Cys120、Cys34 和 Cys59 配位的 Zn 离子。

FiSufS 与 FiSufU 形成复合物时，FiSufU 的结构发生变化，包含 Cys34 - S - SH 的 β - 折叠缩短并转化为环，环长度增加，便于环移动，促进硫从 FiSufS 转移到 FiSufU。

在羽毛降解系统中添加 FiSufS - SufU 复合物，可加快角蛋白水解反应速率，但该复合物需与全细胞 FDB 提取物或其他角蛋白酶混合，才能增强羽毛的亚硫酸解作用。

蛋白质工程：改善微生物角蛋白酶

蛋白质工程是通过改变基因创造新蛋白质结构、提高生物活性的生物技术手段。在角蛋白酶领域，蛋白质工程可增强角蛋白水解活性和热稳定性。

例如，对嗜热地衣芽孢杆菌角蛋白酶 KerZ1 的柔性环进行工程改造，使其更疏水、刚性，从而提高热稳定性；对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）热稳定角蛋白酶 4 - 3Ker 的 S1 底物结合口袋进行改造，提高底物特异性和催化活性。

此外，还有多种基因工程方法用于改造角蛋白酶。如在活性位点引入非天然氨基酸（ncAAs），可提高酶的催化活性，如将铜绿假单胞菌角蛋白酶（KerPA）的 Tyr21、Tyr70 和 Tyr114 替换为非天然氨基酸 pBpF，使其角蛋白水解活性提高 1.3 倍，半衰期延长 8.2 倍。

定向进化技术通过迭代诱变和筛选，可获得具有所需特性的角蛋白酶，如对短短芽孢杆菌（Brevibacillus parabrevis）角蛋白酶 kerBp 进行易错 PCR 定向进化，获得的突变体酶活性显著提高，羽毛降解率从 49% 提升至 88%。

定点诱变可对底物结合口袋进行理性设计，增强角蛋白酶的催化活性和底物特异性，如对铜绿假单胞菌 4 - 3Ker 进行 M128R、A138V 和 V142I 突变，其角蛋白催化活性提高 1.21 倍，热稳定性增强，羽毛降解率提高 32.86%。

构建杂合角蛋白酶也是一种有效策略，如将嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas sp.）角蛋白酶 KerSMD 的 C - 末端结构域替换为其同源蛋白 KerSMF 的 C - 末端结构域，可提高角蛋白水解活性和催化效率；同时替换 N - 和 C - 末端结构域，可增强酶的稳定性和热抗性。

热稳定微生物角蛋白酶的应用

热稳定微生物角蛋白酶在环保降解羽毛废弃物方面具有巨大潜力，可用于农业、动物营养、化妆品、制药和废物管理等多个领域。

在皮革和纺织行业，角蛋白酶可作为环保脱毛剂，使产品表面光滑、柔软；在洗涤剂行业，角蛋白酶可降解血渍、蛋清等蛋白质污渍，如芽孢杆菌属 NKSP7、B. aerius NSMk2 和高地芽孢杆菌 RBDV1 产生的热稳定角蛋白酶，已用于洗衣洗涤剂配方。

在农业领域，羽毛水解产物可用作生物肥料，促进植物生长，如蜡状芽孢杆菌 L10 的角蛋白酶产生的羽毛水解物可提高种子发芽率和植物整体发育。

在能源领域，角蛋白生物质可转化为生物燃料，如经芽孢杆菌属 C4 预处理的鸡毛可作为甲烷生产的底物，有助于实现能源可持续性，减少对化石燃料的依赖。

在医学领域，角蛋白酶可用于降解朊病毒、去除人类胼胝，还可用于皮肤病药物和化妆品配方，目前其在药物递送系统中的应用也在研究中。

总结与结论

家禽业羽毛废弃物因角蛋白难降解，成为主要环境污染物。传统处理方法存在诸多问题，微生物角蛋白水解虽有优势，但中温微生物降解效率低。热稳定细菌角蛋白酶在高温下能高效降解羽毛，其降解过程包括二硫键还原、肽键水解和氨基酸生成。

本综述详细阐述了五种热稳定微生物角蛋白酶的结构特征，它们在羽毛降解过程中发挥不同作用。未来，可通过合理组合这些角蛋白酶，优化羽毛降解系统，提高降解效率。同时，对这些角蛋白酶进行蛋白质工程改造，有望进一步提高其降解效率，但还需实验验证。

热稳定细菌角蛋白酶不仅可用于羽毛污染物降解，还可广泛应用于工业生产、医疗和化妆品制备等领域，是一种极具前景的环保解决方案。