综述：间充质干细胞来源的小细胞外囊泡和凋亡细胞外囊泡在伤口愈合和皮肤再生中的作用：临床前研究的系统综述和荟萃分析

《Journal of Translational Medicine》：Mesenchymal stem cells-derived small extracellular vesicles and apoptotic extracellular vesicles for wound healing and skin regeneration: a systematic review and meta-analysis of preclinical studies

　　

间充质干细胞来源的小细胞外囊泡和凋亡细胞外囊泡在伤口愈合和皮肤再生中的作用：临床前研究的系统综述和荟萃分析

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）自 20 世纪 70 年代被发现以来，在再生医学领域展现出巨大潜力。然而，其临床应用面临诸多挑战，如细胞变异性、可扩展性、递送方法、伦理和安全问题等。近年来，研究发现 MSCs 释放的细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）可作为细胞间通讯的介质，具有与 MSCs 相似的生物学活性，能促进细胞增殖、分化和血管生成，同时抑制细胞凋亡、炎症和纤维化，在组织再生和修复过程中发挥重要作用。

皮肤作为人体与外界环境的主要屏障，易受各种损伤。随着皮肤相关健康问题的日益增多，尤其是在糖尿病和老年人群中，寻找有效的治疗方法迫在眉睫。目前，关于 MSCs 来源的 sEVs 在伤口愈合和皮肤再生方面的临床前和临床研究进展迅速，但对 MSCs 来源的 ApoEVs 的治疗潜力评估相对较少。本研究旨在利用荟萃研究方法，比较 MSCs 来源的 ApoEVs 和 sEVs 在伤口愈合和皮肤再生中的治疗效果，并通过亚组分析确定与增强治疗效果相关的 EVs 特征，为优化 MSC-EVs 疗法的临床应用提供参考。

研究方法

1. 文献检索：本研究方案预先制定、同行评审、注册并发表在国际系统评价前瞻性注册平台（PROSPERO，协议 ID：CRD42024499172）。检索 Web of Science、Embase 和 PubMed 三个数据库中截至 2023 年 9 月 3 日发表的英文文献，并于 2024 年 6 月 15 日进行更新检索。由两名评审员独立筛选文献，根据预定义的排除和纳入标准进行筛选，分歧通过讨论解决。

2. 纳入标准：定性合成第一阶段纳入符合以下标准的同行评审原创研究文章：用英文撰写、评估 MSC-EVs 在伤口愈合和皮肤再生中的治疗作用、在哺乳动物动物模型中进行。排除非原创研究、非英文研究、与 MSC-EVs 在皮肤再生中应用无关的研究以及仅进行体外研究的文章。第二阶段纳入符合更严格标准的研究，包括具有对照干预设计、检测至少一种 EVs 蛋白标记物、表征分离的 MSC-EVs 的大小、通过分化潜能或表面标记物表征 MSCs、从 MSCs 中分离 EVs、宏观或微观、定性或定量研究伤口愈合和皮肤再生以及可获取全文等。

3. 数据提取与合成：由两组评审员独立提取数据，收集研究的一般细节、动物模型特征、MSCs 和 EVs 的分离与表征技术、对 MSCs 或 EVs 的修饰以及剂量等信息。根据公认的基于大小的 EVs 亚型定义，评估作者对相关术语的使用是否符合 MISEV 建议，并依据 ISCT 和 MISEV 2023 指南评估研究对 MSCs 和 EVs 表征的依从性。

4. 质量和偏倚风险评估：两名独立评审员使用 SYRCLE 风险偏倚工具评估偏倚风险，该工具包含 10 个不同参数，用于评估选择偏倚、性能偏倚、检测偏倚、损耗偏倚和报告偏倚等。同时评估样本量计算、报告质量、对 MISEV2023 表征标准的依从性以及对 ISCT 最低标准的依从性。

5. 荟萃分析：对伤口闭合率、瘢痕减少、血管生成和胶原沉积四个结局进行荟萃分析，使用 Review Manager 5.4 软件比较 MSC-EVs 与安慰剂对照。选择标准化均数差（Standardized mean difference，SMD）作为连续结局测量指标，伴随 95% 置信区间（Confidence intervals，CIs），采用随机效应逆方差荟萃分析。通过 Cochrane I2检验评估统计异质性，并进行基于疾病模型和干预特征的亚组分析。

研究结果

1. 检索结果：初始检索共获得 1803 篇文章，去除 594 篇重复文章后，筛选标题和摘要排除 1008 篇不符合要求的文章，对剩余 201 篇文章进行全文评估，排除 129 篇，最终纳入 83 篇研究。2024 年 6 月 15 日更新检索后又纳入 11 篇研究，最终纳入的 83 篇研究发表于 2015 年至 2024 年 6 月 4 日之间，大部分（86.7%）来自中国，且约 82%（n = 64）发表于 2020 年或之后。

2. 纳入研究的一般特征

• 动物模型：所有研究均使用小鼠（73.5%）或大鼠（26.5%）模型，非糖尿病伤口和糖尿病伤口研究分别占 43.4% 和 47.0%，其中 30 项研究使用链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）诱导的糖尿病模型代表 1 型糖尿病，9 项研究使用基因工程糖尿病 db/db 小鼠代表 2 型糖尿病。全层切除伤口是最常见的研究模型（90.4%），其他模型包括硬皮病、烧伤、光老化、特应性皮炎和冻伤等。

• MSC-EVs 的类型和细胞来源：sEVs 是研究最多的 EVs 类型（n = 78），其中 69 项研究将其命名为外泌体，但均未评估 EVs 生物发生途径的推定标记物。其他类型的 EVs 包括 ApoEVs（n = 5），其中 2 项为凋亡小体（Apoptotic bodies，ApoBDs），2 项为凋亡小细胞外囊泡（Apoptotic small extracellular vesicles，ApoSEVs），1 项同时包含 ApoSEVs 和 ApoBDs。MSCs 的动物来源包括人类（69.9%）、小鼠（10.8%）、大鼠（4.8%）、犬（1.2%）和未知（13.3%），组织来源广泛，包括脂肪组织（38.5%）、脐带（22.9%）、骨髓（19.3%）等。

• MSCs 的表征：根据 ISCT 指南，66 项研究（79.5%）满足 MSCs 表征的所有三个标准，17 项研究（20.5%）满足其中两个标准。

• EVs 的收集条件：42 项研究（50.6%）从无血清培养基中收集 sEVs，其他研究使用去除 EVs 的胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）或化学定义培养基。sEVs 的收集时间多为 24 h（n = 10）、48 h（n = 42），ApoEVs 的制备多使用含 0.3 μM 或 0.5 μM 斯托罗波宁（staurosporine）的培养基处理 12 h，部分研究还使用了其他方法。20 项研究（24.4%）未披露收获前细胞培养的条件处理时间。

• EVs 的分离技术：超速离心是最常用的分离技术（97.6%），常结合其他方法如超滤、商业沉淀试剂盒、尺寸排阻色谱和切向流过滤等使用，54 项研究（65.1%）结合两种或更多分离技术以提高纯度。4 项 ApoEVs 研究均仅使用超速离心作为分离技术，1 项研究还使用了 0.45 μm 和 0.22 μm 过滤器对 ApoSEVs 进行亚型分离。

• EVs 的储存：60 项研究（72.3%）报告了收集的 EVs 的储存温度和 / 或介质，多数研究将其储存在 -80℃，使用 PBS 作为悬浮介质，但多数研究未报告冻融循环次数和分离前的储存条件。

• EVs 制剂的表征：大多数研究通过蛋白质定量（54.2%）、大小分布（98.8%）、形态分析（98.8%）和表面标记物表达（100%）对 EVs 进行表征。蛋白质定量主要使用二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）法，少数研究使用 ELISA 试剂盒或 Bradford 法。多数研究未报告 EVs 总蛋白产量，RNA 定量仅在两项研究中进行。根据 MISEV 2023，只有 46 项研究（55.4%）充分表征了 EVs 的特征蛋白，许多研究未报告至少一种阳性胞质标记物和非 EV 共分离结构的主要成分以评估纯度，ApoEVs 研究仅检测凋亡标记物，未关注 EVs 特征蛋白，且无研究提供分离的 EVs 可能的细胞内起源的额外标记信息。

• MSC-EVs 的修饰：60 项研究（72.3%）对 EVs 进行了修饰，包括对亲本细胞的改变（42.3%）、直接修饰 EVs（30.1%）和联合治疗（2%）。对亲本细胞的改变包括在不同培养条件下培养、基因修饰等，直接修饰 EVs 包括将其加载到生物材料支架中，联合治疗使用了叔丁基对苯二酚（tert-butylhydroquinone，tBHQ）或二甲双胍等。

• MSC-EVs 的给药和剂量方案：皮下注射（45.8%）和局部给药（22.9%）是最常见的给药途径，给药剂量单位差异较大，包括绝对蛋白量、颗粒数或一定数量 MSCs 释放的 EVs 量等。最常用的剂量为 100 μg EVs 蛋白在 100 μL PBS 中（16.7%）和 200 μg EVs 在 100 μL PBS 中（10.8%），ApoEVs 研究中常用剂量为 50 μg 蛋白。多数研究（59.0%）给予单剂量治疗，多剂量治疗研究的中位数为 3 剂（范围 2 - 42 剂）。

• MSC-EVs 研究的报告质量：研究报告质量普遍较低，在 EVs 表征方面，浓度、阳性胞质标记物和 EVs 可能的细胞内起源等关键细节报告不足；在体内实验方面，16 项研究（19.3%）未披露样本量，无研究说明动物模型样本量的计算方法，8 项研究未揭示给药剂量，7 项研究未明确治疗剂量的 EVs 浓度，仅提及溶液体积。在结果报告方面，只有 18 项研究（21.7%）提供了实际数值数据，多数研究未报告测量结果的绝对 p 值和置信区间，缺乏全面的统计分析。

3. 荟萃分析结果

• 血管密度：10 项评估血管密度的研究纳入荟萃分析，结果表明 MSC-EV 给药对支持血管发育有显著影响（SMD：5.39，95% CI：4.50 - 6.29；SMD：3.50，95% CI：2.32 - 4.68，分别在糖尿病和非糖尿病模型中），亚组分析显示 sEVs 在增加血管密度方面比 ApoEVs 更有效，但 ApoEVs 研究数量有限。

• 胶原沉积：11 项研究评估了胶原沉积，结果显示 MSC-EVs 给药显著改善了胶原沉积（SMD = 2.60，95% CI：1.96 - 3.24；SMD = 5.16，95% CI：3.85 - 6.47，分别在糖尿病和非糖尿病模型中），亚组分析表明 ApoSEVs 在增加胶原沉积方面比 sEVs 和 ApoBDs 更有效，但相关研究数量有限。

• 瘢痕宽度：3 项评估瘢痕宽度的研究纳入荟萃分析，结果显示 MSC-EVs 干预对减少瘢痕宽度有显著效果（SMD = -15.96，95% CI：-23.83 - -8.09，p < 0.0001；SMD = -7.25，95% CI：-8.98 - -5.52，p < 0.00001，分别在糖尿病和非糖尿病模型中）。

• 主要结局：伤口闭合结局：31 项研究符合伤口闭合结局的荟萃分析标准，结果显示 MSC-EVs 治疗显著提高了伤口闭合率（SMD = 3.60，95% CI：3.23 - 3.96，p < 0.00001），糖尿病和非糖尿病组的亚组分析也表明 MSC-EVs 治疗在加速伤口闭合方面均有效，但异质性较高。亚组分析显示，sEVs 在促进伤口闭合方面效果优于 ApoEVs，MSC 组织来源、给药途径、动物物种和免疫相容性等因素与 EVs 疗效相关。在小鼠伤口愈合研究中，ApoSEVs 在伤口闭合方面表现出比 ApoBDs 和 sEVs 更好的疗效，皮下注射比敷料 / 覆盖在促进伤口闭合方面效果更好，sEVs 的治疗效果似乎不存在剂量反应关系。

• 次要结局

• 安全性：所有纳入研究均未报告有害事件，表明 MSC-EVs 干预在促进伤口愈合和皮肤再生方面具有安全性。

4. 偏倚风险评估：使用 SYRCLE’s ROB 工具评估动物实验的偏倚风险，结果显示大多数研究在大多数领域的偏倚风险不明确。虽然部分研究报告了随机化分组，但只有一项研究提供了随机化方法的细节，多数研究在分配隐藏、人员盲法、结果评估盲法等方面存在不足，部分研究存在高损耗偏倚风险。

研究结论

本综述综合了大量关于 MSC-EVs 在伤口愈合和皮肤再生中的临床前研究，结果表明 MSC-EVs 在糖尿病和非糖尿病动物模型中均具有促进伤口愈合和皮肤再生的潜力，在伤口闭合率、血管密度、胶原沉积和瘢痕宽度等方面均有显著改善。亚组分析显示，ApoSEVs 在伤口闭合结局方面可能比 ApoBDs 和 sEVs 更有效，但在胶原沉积和血管生成方面的比较结果尚不确定。在常用给药途径中，皮下注射在促进伤口闭合、胶原沉积和血管生成方面优于局部敷料或覆盖。在 MSCs 来源方面，ADSCs 在伤口闭合率和胶原沉积方面效果最佳，BMMSCs 在血管生成方面表现更优。

然而，目前 MSC-EVs 的研究存在诸多问题。在制备和应用方面，收集条件、分离方法、储存方法、修饰、治疗剂量、给药途径和频率等方面存在高度异质性，缺乏标准化协议，影响了研究间的可比性和临床转化。在研究质量方面，对国际指南（如 ISCT 标准和 MISEV 2023）的依从性不理想，需要提高研究的严谨性和报告质量。此外，EVs 的命名不够精确，对 ApoSEVs 和 ApoBDs 功能差异的潜在机制了解不足，EVs 的精确治疗载荷尚未确定，在临床转化前还需要确定最佳的 EVs 修饰策略。未来需要进一步研究解决这些问题，以推动 MSC-EVs 疗法在临床中的应用。