综述：利用新工具剖析内皮细胞异质性

《Cell Regeneration》：Dissecting endothelial cell heterogeneity with new tools

这篇综述聚焦内皮细胞异质性，探讨其在不同器官中的差异及新研究工具的应用。

　　

### 血管内皮细胞的重要性与研究背景
血管是循环系统的基础，对营养运输、免疫监测和器官发育至关重要。其发育分为血管发生（vasculogenesis）和血管生成（angiogenesis）两个阶段。在血管发生过程中，中胚层祖细胞分化为血管内皮细胞（VEC），组装成原始血岛，进而形成原始血管丛。血管生成则是从已有的血管中形成新血管，这一过程受到缺氧诱导因子信号通路的调控，组织缺氧时会释放血管内皮生长因子 A（VEGF-A），吸引血管向缺氧区域生长。

过去，血管内皮细胞被认为是均质的，但近年来研究发现，其在不同器官以及同一器官的不同血管类型中存在显著异质性。这种异质性对维持器官正常功能和疾病发展具有重要影响，因此研究内皮细胞异质性成为了血管生物学领域的关键课题。

内皮细胞的异质性

器官内异质性

• 尖端和柄细胞特化：在胚胎发育过程中，组织缺氧会触发血管生成，VEGF-A 与尖端细胞上的血管内皮生长因子受体 - 2（VEGFR2）结合，促进尖端细胞的存活和迁移。Delta-like 蛋白 4（DLL4）作为尖端细胞身份的关键调节因子，与相邻柄细胞上的 NOTCH 受体相互作用，限制 VEGFR2 表达，抑制柄细胞迁移，维持其表型。此外，转化生长因子 -β（TGF-β）和骨形态发生蛋白 9/10（BMP9/10）等信号通路也参与了尖端 - 柄细胞的特化过程。随着血管丛的生长和成熟，BMP 和 NOTCH 信号之间的相互作用精细地调节着血管分支，确保血管在发育过程中的正确组织。

• 动脉 - 静脉特化：胚胎发育过程中，VEC 会根据复杂的信号网络分化为动脉或静脉表型。EphrinB2 和 EphB4 分别是动脉和静脉内皮细胞的分子标记，它们之间的相互作用有助于防止动静脉 VEC 混合，维持血管身份。VEGF-A 浓度在动脉 - 静脉特化中起关键作用，高水平的 VEGF-A 促进动脉特化，激活 NOTCH 和 ERK1/2 通路，驱动动脉基因表达；低水平则有利于静脉身份的形成。WNT、SHH 等信号通路也参与了早期动脉 - 静脉特化过程，而血流产生的机械剪切应力进一步巩固了动脉 - 静脉的特化。

器官间异质性

不同器官的血管内皮细胞在结构、功能和分子表达谱上存在差异，以适应各器官的生理功能。例如，大脑血管内皮细胞形成紧密的血脑屏障（BBB），严格调节细胞和营养物质的进出；肺血管内皮细胞具有独特的结构和功能，适应气体交换的需求；肾脏血管内皮细胞参与调节血液流动、过滤和重吸收等过程。

• 大脑：在小鼠胚胎发育过程中，中枢神经系统（CNS）最初是无血管的，随后原始血管内皮细胞聚集形成神经周围血管丛（PNVP），并逐渐分化为脑膜的动脉、毛细血管和静脉。接着，血管从 PNVP 侵入中枢神经系统实质，形成神经内血管丛（INVP）。脑毛细血管具有分区特征，其内皮细胞沿动脉 - 静脉轴呈现连续的转录变化，且这种分区与神经退行性疾病相关。

• 肺：肺血管具有双重功能，为循环系统和呼吸系统服务。肺泡周围的毛细血管存在异质性，Car4⁺ 气细胞毛细血管（aCaps）和普通毛细血管（gCaps）在基因表达和形态上存在差异，aCaps 对肺的成熟至关重要，其缺失会导致肺泡增大。在肺部疾病中，aCaps 的变化与疾病进展密切相关。

• 心脏：心脏冠状动脉血管的发育主要源于窦静脉和心内膜的内皮细胞分化。这些内皮细胞在胚胎发育过程中响应不同的分子信号，逐渐形成冠状动脉。成年后，冠状动脉血管的生长可以通过 VEGFB 转导或 VEGFR2 过表达等方式增强。研究发现，成年冠状动脉内皮细胞不保留其祖细胞的分子特征，呈现 “趋同分化” 现象。

• 肾脏：肾脏血管内皮细胞具有显著的异质性，肾小球内皮细胞形成过滤屏障，而肾小管和肾周毛细血管内皮细胞参与液体吸收和分泌。单细胞分析揭示了皮质、髓质和肾小球内皮细胞的分子差异，以及它们在病理条件下的独特反应。例如，在急性水剥夺时，髓质内皮细胞会发生转录变化，以支持生存和尿液浓缩。

• 肝脏：肝脏内皮细胞在肝脏功能中发挥重要作用，包括接收血液、清除大分子和调节免疫反应。肝窦内皮细胞存在分区现象，对肝细胞的特化至关重要。在肝硬化等疾病中，肝窦内皮细胞会发生毛细血管化，导致其功能异常。此外，肝脏内皮细胞分泌的因子 VIII 在凝血过程中起重要作用，为血友病 A 的治疗提供了新的思路。

• 视网膜：视网膜血管系统的形成受多种信号通路和细胞相互作用的驱动，对维持视网膜的正常功能至关重要。视网膜血管内皮细胞的异常会导致营养缺乏、代谢失衡和神经功能障碍，是多种视网膜退行性疾病的重要特征。视网膜血管从中央视网膜动脉发出，形成多个相互连接的血管网络，不同区域的内皮细胞具有独特的特征。

内皮细胞在生理和病理条件下的异质性

除了器官内和器官间的异质性，内皮细胞在不同疾病、衰老以及不同性别之间也存在异质性。

• 疾病状态下的变化：在阿尔茨海默病中，大脑内皮细胞数量增加；在特发性肺纤维化中，支气管内皮细胞增多，而其他亚型比例下降。在动脉粥样硬化斑块中，表达促炎和促动脉粥样硬化基因的内皮细胞被 “激活”，促进疾病进展。疾病还会诱导新的内皮细胞亚型产生，改变内皮细胞之间的相互作用，甚至导致内皮细胞转分化。

• 衰老相关的异质性：随着年龄的增长，血管壁结构发生变化，包括中层和内层硬度增加、弹性降低、内皮功能障碍和血管修复缺陷。衰老的内皮细胞还表现出炎症反应增强、氧化应激增加、基因表达改变以及 DNA 修复能力下降等特征。

• 性别差异：在雄性和雌性小鼠的多个器官中存在特定的内皮细胞亚群，其基因表达受性别影响。雌激素和睾酮等性激素对血管功能和内皮细胞健康有显著影响，雌激素通过激活内皮一氧化氮合酶（eNOS）产生一氧化氮（NO），调节血管舒张；睾酮则促进内皮祖细胞的增殖。绝经后女性心血管疾病风险增加，表明女性激素在维持内皮细胞健康方面的重要作用。

研究内皮细胞异质性的新兴工具

单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）在血管研究中的应用

scRNA-seq 技术能够在单细胞水平分析转录组，为研究内皮细胞异质性提供了强大的工具。它可以识别疾病相关的内皮细胞亚群，揭示不同组织和疾病状态下内皮细胞的多样性，以及在发育、稳态和疾病进展过程中的动态转录变化。

• 揭示内皮细胞多样性：scRNA-seq 发现了大脑中负责维持血脑屏障的特殊内皮细胞群体，其高表达紧密连接蛋白和转运蛋白；在肺部，识别出了 aCaps 和 gCaps 两种不同的肺泡毛细血管内皮细胞；在肝脏中，鉴定出具有独特转录谱的肝窦内皮细胞。这些发现强调了内皮细胞特化在器官功能和疾病中的重要性。

• 研究动态变化：在胚胎发育过程中，scRNA-seq 捕捉到内皮细胞从间充质祖细胞到形成原始血管网络，再到血管生成的转变过程，识别出关键的转录因子和信号通路。在成年组织中，它可以研究内皮细胞对各种生理挑战的反应，如缺氧、剪切应力和炎症。在血管衰老研究中，scRNA-seq 揭示了内皮细胞衰老的分子机制，为开发早期检测生物标志物和治疗干预措施提供了依据。

• 面临的挑战与未来方向：尽管 scRNA-seq 技术取得了显著进展，但仍面临一些挑战，如难以捕获低丰度内皮细胞、组织解离过程可能影响转录谱准确性、成本高昂和技术复杂等。未来的发展将集中在提高灵敏度、准确性和可及性，结合其他组学技术，如单细胞核 RNA 测序（snRNA-seq）、单细胞染色质可及性测序（scATAC-seq）和蛋白质组学，以更全面地了解内皮细胞异质性。

类器官在血管研究中的应用

类器官是一种有前途的研究模型，能够在体外构建器官形态，为研究人类内皮细胞在三维器官发育和疾病进展中的功能提供了新途径。

• 血管类器官的构建方法：目前构建血管类器官的方法包括与内皮细胞系共培养、与血管类器官共培养、将干细胞共分化为器官和血管细胞以及利用 3D 打印技术等。其中，将人多能干细胞（hPSC）诱导分化为内皮细胞是关键步骤，ETS 变体转录因子 2（ETV2）在这一过程中发挥着重要作用。通过调节 ETV2 的表达，可以高效地将 hPSC 分化为具有稳定功能的内皮细胞。

• 组织血管化的类器官模型：不同器官的类器官模型在研究内皮细胞异质性方面具有独特的优势。在大脑类器官中，与内皮细胞共培养或融合血管类器官可以模拟神经血管单元的相互作用，但缺乏免疫生态位是其面临的主要挑战。肺类器官能够模拟肺部的细胞结构和功能，但在构建功能性呼吸组织和血管化类器官方面仍有待改进。心脏类器官可以研究心脏血管的成熟和病理过程，但需要解决细胞结构成熟、随机定位和细胞组成调控等问题。肾脏类器官已显示出与人类肾内皮相似的特征，但在血管稳定性和疾病状态下的血管网络扰动方面仍需进一步研究。肝脏类器官可以研究肝脏的功能和疾病，但需要解决免疫排斥和血管系统特化等问题。视网膜类器官可以研究视网膜疾病机制，但在实现视网膜细胞空间排列和成功移植方面面临挑战。

• 未来展望：实现类器官的功能性血管化是未来研究的重点，需要协调血管化过程与微环境因素，构建具有器官特异性血管特征的类器官系统。这将有助于深入了解内皮细胞在健康和疾病状态下的功能，为开发新的治疗策略提供有力支持。

结论与展望

血管内皮细胞异质性的发现彻底改变了血管生物学研究的格局。尽管在动脉 - 静脉内皮细胞分化和尖端细胞形成的调控方面取得了一定进展，但驱动器官特异性内皮细胞分化的分子机制仍有待深入研究。

目前，小鼠模型为研究血管内皮细胞基因功能提供了重要手段，但仍需要更多的系统来研究人类细胞中的基因功能。传统的二维（2D）内皮细胞培养系统无法模拟复杂的三维器官环境，而血管化类器官的发展为解决这一问题提供了新的希望。未来的研究应致力于提高类器官的血管化程度，构建包含器官特异性内皮细胞的类器官，以更好地模拟生理条件，深入研究血管内皮细胞在人类发育和疾病进展中的功能。这将为开发治疗血管相关疾病的新策略提供重要的理论基础，有望推动再生医学和组织工程领域的发展。