建立通用四价 HPV 疫苗体外相对效力（IVRP）检测方法取代体内效力试验

《npj Vaccines》：Establishing a universal IVRP method for quadrivalent HPV vaccines to replace in vivo potency tests

为解决 HPV 疫苗效力评估难题，研究人员开展 IVRP 研究，建立通用检测方法，有望取代体内试验。

　　人乳头瘤病毒（HPV）感染与宫颈癌的发生发展密切相关，HPV 疫苗可有效预防 HPV 感染，进而预防宫颈癌。然而，目前 HPV 疫苗的供应存在不足，且在疫苗效力评估方面存在诸多问题。一方面，由于研究技术限制和生产成本高昂，HPV 疫苗的产量难以满足全球接种需求；另一方面，现有的疫苗效力评估方法存在差异，缺乏统一的标准。例如，不同研究中用于检测型特异性抗原的抗体、参考材料、试剂及计算方法各不相同，导致检测结果缺乏可比性。此外，虽然已有多种 HPV 型特异性中和单克隆抗体，但它们可能不适用于基于不同表达系统的 IVRP 检测，且与体内效力的相关性尚未明确，这严重阻碍了 HPV IVRP 检测方法的标准化以及体外检测取代体内效力试验的进程。

为了解决这些问题，厦门大学公共卫生学院国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心、中国科学院生物物理研究所感染与免疫重点实验室、国家食品药品监督管理总局药品审评中心等机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《npj Vaccines》上，为 HPV 疫苗效力评估提供了新的解决方案。

研究人员采用了多种关键技术方法。在抗体筛选与制备方面，从接种疫苗个体的外周血单核细胞（PBMCs）中分离出单记忆 B 细胞，经测序和克隆获得人 IgG1 单克隆抗体（mAbs），并进一步制备出 Fab 片段。在检测分析技术上，运用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗体结合活性；通过假病毒中和试验（PBNA）测定中和活性；采用抗体竞争试验筛选识别优势表位的抗体；借助冷冻电镜（cryo-EM）解析 HPV L1 与抗体复合物的结构；同时进行体内效力和体外效力试验，对比两者相关性。此外，还进行了协作验证，将四价 IVRP 试剂盒分发给六家疫苗制造商，评估其检测效果。

研究结果如下：

1. 抗体筛选：通过 ELISA 和 PBNA 筛选出了具有强抗原结合能力（EC50?值低于 20 ng/ml）和强中和活性（IC50?值低于 10 ng/ml）的单克隆抗体，如 6-F5-77、11-F5-187、16-F5-196 和 18-F5-203。这些抗体还具有构象敏感性，能反映 HPV VLP 抗原的构象变化。在人抗 HPV 血清中，它们识别的表位与人体接种疫苗后产生的抗体识别的表位一致或相似，具有免疫优势。
2. IVRP 方法建立与验证：以广谱结合抗体 C4-F5-127 为捕获抗体，6-F5-77、11-F5-187、16-F5-196 和 18-F5-203 为检测抗体，建立了双抗体夹心 ELISA 法用于 IVRP 评估。该方法准确性高，相对偏差在 30% 以内，几何变异系数（GCV）小于 30%，线性回归相关系数超过 0.98，特异性良好。
3. 复合物结构解析：cryo-EM 结构分析揭示了四种抗体与 HPV L1 五聚体的结合模式和中和机制。6-F5-77、11-F5-187 和 18-F5-203 结合在五聚体平台中央腔的一侧，可能通过阻断 L1 衣壳的构象变化或 L2 N 端的暴露来抑制 HPV 感染；16-F5-196 则簇集在五聚体的顶部和边缘，能最大程度地结合 VLPs，抑制其与细胞受体的结合。
4. 体内外效力相关性：对经不同程度热加速破坏的疫苗进行体内外效力检测，结果显示两者具有良好的相关性（R2值均大于 0.5），表明 IVRP 可作为评估疫苗质量的有效替代方法。
5. 协作验证：六家疫苗制造商对 IVRP 试剂盒进行协作验证，结果表明该试剂盒可用于检测疫苗原液和成品，检测结果与各制造商内部方法的偏差在可接受范围内。

研究结论与讨论部分指出，本研究成功建立了通用的 IVRP 检测方法，可用于识别多家制造商生产的相应 HPV 亚型的疫苗原液和成品，检测结果与各公司内部方法相似。该方法能监测生产过程中的抗原漂移，且基于对抗体中和机制和结合模式的研究，为疫苗设计提供了参考。与体内效力试验相比，IVRP 具有高效、灵敏、检测周期短、重复性好和操作简便等优点，有望逐渐取代体内效力试验，在 HPV VLP 疫苗的生命周期管理中发挥重要作用。此外，该方法不仅适用于四价和二价 HPV 疫苗，未来还可基于此建立其他亚型的检测方法，用于评估 9 价及以上 HPV 疫苗，促进体外和体内研究数据的积累。总之，本研究为 HPV 疫苗效力评估提供了一种可靠的体外方法，对推动 HPV 疫苗的研发、生产和质量控制具有重要意义。