Decoy-PROTAC：攻克 “不可成药” STAT3 转录因子的创新策略

《Cell Death & Disease》：Decoy-PROTAC for specific degradation of “Undruggable” STAT3 transcription factor

研究人员针对 STAT3 难以成药问题，开展 Decoy-PROTAC 研究，有效降解 STAT3，展现强大抗肿瘤潜力。

　　

研究背景：肿瘤治疗困境与新希望的探寻

在肿瘤治疗的战场上，寻找有效的治疗靶点和策略一直是科研人员不懈追求的目标。信号转导和转录激活因子 3（STAT3）作为一个关键角色，在肿瘤的发生和发展过程中发挥着重要作用。它参与细胞增殖、存活、分化以及血管生成等多个关键过程，在众多人类肿瘤，如实体瘤和血液肿瘤中都异常激活。这使得 STAT3 成为了极具吸引力的潜在治疗靶点，理论上抑制它可以有效遏制肿瘤进展，而且对大多数正常组织影响较小。

然而，现实却给科研人员带来了巨大挑战。由于 STAT3 缺乏易于被小分子抑制的活性位点或变构调节口袋，开发针对它的临床抑制剂困难重重，STAT3 也因此被视为 “不可成药” 的靶点。目前常见的抑制 STAT3 信号通路的方法，比如抑制其上游激酶，虽然能在一定程度上降低 STAT3 的活性，但存在脱靶毒性等问题。直接靶向 STAT3 蛋白的方法，像破坏其 SH2 结构域、DNA 结合结构域（DBD）或 N 端结构域（NTD），也因为诸如低水溶性、有限的选择性等问题，无法顺利通过临床审批。

在这样的困境下，科研人员急需找到一种创新的方法来突破僵局，蛋白质水解靶向嵌合体（PROTAC）技术的出现带来了新的希望，基于此，研究人员开展了一系列研究，试图利用该技术攻克 STAT3 这个 “不可成药” 的靶点。

研究机构与研究内容

福州大学的研究人员利用 PROTAC 技术，构建了一种针对 STAT3 蛋白的高度特异性诱饵靶向蛋白降解系统，即 Decoy-PROTAC（D-PROTAC）。该系统将靶向 STAT3 的 DNA 诱饵与 E3 连接酶配体通过点击化学方法融合在一起。

研究人员通过一系列实验，探究了 D-PROTAC 对 STAT3 蛋白的降解作用，以及这种降解对肿瘤细胞生长、细胞周期、凋亡、迁移、侵袭和免疫逃逸等方面的影响，还在体内动物模型中评估了其抗肿瘤效果。相关研究成果发表在《Cell Death and Disease》杂志上。

主要技术方法

研究中运用了多种关键技术方法。在合成 D-PROTAC 时，采用点击化学方法将 DNA 诱饵与 E3 连接酶配体结合。通过质谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）对合成产物进行表征，以确认其结构和合成的成功性。利用蛋白质免疫印迹（WB）技术检测蛋白表达水平，分析 D-PROTAC 对 STAT3 及其下游蛋白的影响。借助分子模拟技术预测 D-PROTAC、STAT3 和 E3 连接酶形成的三元复合物的结合模式。运用细胞成像技术，如共聚焦显微镜和流式细胞术，研究 D-PROTAC 的细胞摄取情况。此外，还通过细胞划痕实验、Transwell 侵袭实验、细胞周期分析、克隆形成实验、CCK-8 实验等，从多个角度评估 D-PROTAC 对肿瘤细胞的作用，并建立小鼠异种移植瘤模型进行体内抗肿瘤研究。

研究结果

1. D-PROTAC 的设计与合成：研究人员选择了特定的单链 DNA 序列作为 STAT3 诱饵（STAT3-D），它能形成发夹结构，增强稳定性。同时选用 VHL 配体 - 接头偶联物 8（VHL-L）靶向 E3 连接酶。通过无铜应变促进叠氮 - 炔环加成（SPAAC）反应构建了 D-PROTAC。合成了 6 种不同接头长度的 D-PROTAC，质谱和 PAGE 分析证实了其成功合成。
2. STAT3 蛋白的降解：以 HeLa 和 MCF-7 细胞为模型，研究发现 11 碱基接头的 D11-PROTAC 对 STAT3 包括磷酸化 STAT3（pSTAT3）的降解效果最为显著。分子模拟显示，D11-PROTAC 能使 STAT3 和 VHL 处于最佳作用距离，促进 STAT3 的泛素化和降解。
3. 稳定性和细胞摄取：D11-PROTAC 在酸性缓冲液（pH = 5）和含 10% 胎牛血清（FBS）的培养基中稳定性良好。共聚焦显微镜和流式细胞术表明，它能有效被 HeLa 和 MCF-7 细胞摄取。
4. 降解机制验证：使用蛋白酶体抑制剂 MG132 和 VHL 配体 VHL-L 进行实验，证实 D11-PROTAC 通过 VHL 介导的泛素化和蛋白酶体途径降解 STAT3。同时，D11-PROTAC 能特异性降解 STAT3，对其他 STAT 家族成员影响较小。
5. 对肿瘤细胞功能的影响：D11-PROTAC 处理后，HeLa 和 MCF-7 细胞中血管内皮生长因子（VEGF）表达降低，细胞迁移和侵袭能力受到抑制。此外，它还能下调细胞周期蛋白 D1（cyclin D1）的表达，使细胞周期阻滞在 G0/G1 期，抑制肿瘤细胞增殖。同时，D11-PROTAC 能降低 c-Myc 和抗凋亡蛋白 BCL-2 的表达，诱导肿瘤细胞凋亡。在免疫逃逸方面，D11-PROTAC 通过降解 STAT3，降低了 PD-L1 的表达，促进了 T 细胞的激活，增强了抗肿瘤免疫反应。
6. 体内抗肿瘤评估：在 MCF-7 荷瘤小鼠模型中，D11-PROTAC 耐受性良好，能有效抑制肿瘤生长。免疫荧光染色、H&E 染色、TUNEL 检测和 Ki67 染色等结果显示，它能下调肿瘤组织中 STAT3 及其下游蛋白的表达，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，且对主要器官无明显生理损伤。

研究结论与意义

研究成功设计、合成、表征并验证了 D-PROTAC 对 STAT3 蛋白的精确降解作用。D-PROTAC 通过形成 STAT3、D-PROTAC 和 VHL 的三元复合物，借助 VHL 和蛋白酶体机制，高效降解癌细胞中的 STAT3。它不仅能选择性地降解 STAT3，还能下调 STAT3 调控的多个下游靶基因，从而引发细胞周期阻滞、促进细胞凋亡、抑制肿瘤迁移和增殖以及抑制肿瘤免疫逃逸，展现出强大的抗肿瘤效果。这项研究为 “不可成药” 的 STAT3 蛋白降解剂的临床开发奠定了基础，为 STAT3 相关疾病的治疗提供了新的策略和潜在的治疗药物，具有重要的临床应用前景和科学研究价值。