基于外泌体 “吃我 / 别吃我” 双靶向策略治疗药物性肝损伤的研究进展

《Cell Reports Medicine》：A combined “eat me/don’t eat me” strategy based on exosome for acute liver injury treatment

本文构建基于外泌体的 “吃我 / 别吃我” 策略，改善肝损伤，为药物性肝损伤（DILI）提供新疗法。

　　

### 研究背景
药物性肝损伤（Drug-induced liver injury，DILI）是药物研发和临床应用中的关键难题，其发病机制复杂，缺乏有效的治疗策略。肝脏中的肝窦内皮细胞（Liver sinusoidal endothelial cells，LSEC）虽占比相对较小，但在肝脏再生中发挥着关键作用，分泌的血管生成素如 Wnt2 等对肝脏修复意义重大。Wnt2 通过激活 Wnt/β-catenin 信号通路，促进肝细胞增殖和肝祖细胞分化，在肝脏修复过程中起重要调控作用。

外泌体作为天然的纳米载体，具有良好的生物相容性和低免疫原性，在药物递送领域潜力巨大。通过对其进行工程化改造，可实现靶向递送。然而，目前针对 LSEC 的外泌体递送系统尚未得到充分开发，且现有外泌体递送系统面临被单核吞噬细胞系统（Mononuclear phagocyte system，MPS）清除的问题，限制了其疗效。CD47 作为 “别吃我” 信号，可抑制巨噬细胞的吞噬作用，基于此，研究人员开发了结合双靶向效应的外泌体策略，以解决上述难题。

RLTR 修饰外泌体的合成与表征

研究人员从 bEnd.3 细胞的培养基中分离出外泌体（Exo），通过透射电子显微镜（Transmission electron microscopy，TEM）、纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle tracking analysis，NTA）和蛋白质免疫印迹（Western blotting）等技术对其进行表征，结果显示分离的 Exo 具有典型的双层膜结构，粒径主要分布在 40 - 200nm，且表达外泌体标记蛋白。

为实现外泌体对 LSEC 的靶向递送，研究人员合成了 DMPE - PEG2000 - CRLTRKRGLK（RLTR），并通过疏水插入法将其修饰到外泌体膜上。TEM 分析表明，RLTR 修饰后的外泌体（RLTR - Exo）保持了原有的球形形态和膜完整性。通过纳米流式细胞术（Nanoflow cytometry，NanoFCM）检测发现，RLTR - Exo 的粒径略有增加，且修饰效率高达 87.5%，证实了外泌体表面成功修饰了 RLTR。

RLTR 表面修饰增强外泌体对 LSEC 的摄取

体外实验中，研究人员将 Exo 和 RLTR - Exo 用荧光染料标记后与小鼠原代 LSEC 共孵育，通过共聚焦激光扫描显微镜（Confocal laser scanning microscopy，CLSM）观察发现，RLTR - Exo 组的荧光强度显著高于 Exo 组，表明 RLTR 修饰增强了外泌体与 LSEC 的结合能力。此外，体内实验通过对注射荧光标记外泌体的小鼠进行器官分布荧光成像，发现 RLTR 修饰显著促进了外泌体在肝脏的富集，延长了其在肝脏的半衰期，且 RLTR - Exo 在 LSEC 中的摄取效率明显高于 Exo。

为减少巨噬细胞对实验结果的干扰，研究人员设计了顺序注射策略，先注射未修饰的外泌体饱和巨噬细胞，再注射 RLTR - Exo。免疫荧光染色结果显示，顺序注射策略显著促进了 LSEC 对 RLTR - Exo 的摄取，且减少了 RLTR - Exo 在库普弗细胞（Kupffer cells，KCs）中的分布。但该策略在抑制巨噬细胞非特异性吞噬方面效果有限。

CD47 工程化外泌体逃避巨噬细胞吞噬

为使外泌体逃避巨噬细胞的吞噬，研究人员将 CD47 过表达的慢病毒转染 bEnd.3 细胞，制备了表面表达 CD47 的外泌体（Exo^CD47）。通过蛋白质免疫印迹、免疫金透射电子显微镜（Immunogold transmission electron microscopy，IG - TEM）和酶联免疫吸附测定（Enzyme - linked immunosorbent assay，ELISA）等技术证实了 Exo^CD47的外泌体特征，且其 CD47 蛋白表达水平显著高于对照 Exo。

体外实验中，将 Exo 和 Exo^CD47与 RAW264.7 细胞共孵育，CLSM 和荧光成像结果显示，Exo^CD47组的荧光强度明显低于 Exo 组，表明 Exo^CD47被巨噬细胞吞噬的效率较低。体内实验通过对注射 DiO 标记外泌体的小鼠进行分析，发现 Exo^CD47在 KCs 中的摄取效率显著低于 Exo，进一步证明了 CD47 工程化外泌体可有效逃避巨噬细胞的吞噬。

功能性 Wnt2 mRNA 封装到工程化外泌体中

研究人员将编码 Wnt2 的慢病毒转染 CD47 过表达的 bEnd.3 细胞（CD47^OE - bEnd.3），建立了 CD47^OE&Wnt2^OE - bEnd.3 细胞系，并从中分离出 Wnt2 mRNA 富集的外泌体（Wnt2@Exo^CD47）。定量逆转录聚合酶链反应（Quantitative reverse - transcription PCR，RT - qPCR）分析显示，Wnt2@Exo^CD47中 Wnt2 mRNA 的表达量比对照外泌体高约 100 倍。

体外实验表明，Wnt2@Exo^CD47可被 293T、人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）和原代 LSEC 摄取，且能显著提高细胞培养上清液中 Wnt2 的浓度，促进 Wnt2 mRNA 在原代 LSEC 中的表达，激活原代肝细胞中 Wnt 信号通路的下游靶基因。这表明功能性 Wnt2 mRNA 可稳定封装在外泌体中，并有效传递到细胞内发挥作用。

工程化外泌体治疗改善急性肝损伤

研究人员构建了二甲基亚硝胺（Dimethylnitrosamine，DMN）和对乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP）诱导的急性肝损伤小鼠模型，以评估工程化外泌体的治疗效果。体内实验结果显示，RLTR - Wnt2@Exo^CD47在急性肝损伤小鼠肝脏中的富集能力显著增强，且能特异性靶向 LSEC。

在 DMN 和 APAP 诱导的肝损伤小鼠模型中，RLTR - Wnt2@Exo^CD47治疗显著改善了肝脏的外观和功能，降低了血清中丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase，AST）和总胆红素（Total bilirubin，TBIL）的水平，增加了白蛋白（Albumin，ALB）的水平。组织学分析表明，RLTR - Wnt2@Exo^CD47治疗促进了肝细胞增殖，减少了肝脏坏死区域，降低了肝细胞死亡的发生率，同时减轻了炎症细胞的浸润。

RNA 测序（RNA sequencing，RNA - seq）和基因集富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA）结果显示，RLTR - Wnt2@Exo^CD47治疗上调了与 Wnt 信号通路、细胞周期正调控、肝脏再生和肝细胞分化相关的基因表达。这些结果表明，RLTR - Wnt2@Exo^CD47通过促进肝细胞增殖，有效改善了急性肝损伤。

工程化外泌体的初步安全性评估

体外实验通过细胞计数试剂盒 - 8（Cell Counting Kit - 8，CCK8）检测发现，RLTR - Wnt2@Exo^CD47在浓度高达 100μg/mL 时对 bEnd.3 细胞无明显细胞毒性，且能促进细胞增殖。体内实验对健康小鼠注射 RLTR - Wnt2@Exo^CD47后，检测血清中的肝肾功能指标和心肌酶，结果显示除肾功能指标外，其他指标无显著变化，且 H&E 染色表明主要器官无坏死或炎症迹象，表明工程化外泌体具有良好的生物相容性和安全性。

研究讨论

LSEC 在肝脏再生和疾病发展中起着重要作用，是治疗急性肝损伤的潜在靶点。Wnt2 作为 LSEC 分泌的关键因子，在肝脏修复中具有重要意义。RLTR 或 KLGRKRTLR（KLGR）等肽含有 RXR 或 RXXR 基序，可特异性结合 LSEC 表面的受体，为 LSEC 靶向药物递送提供了新的策略。

外泌体作为药物递送载体具有诸多优势，通过表面工程化修饰可实现靶向递送。本研究通过疏水插入法成功修饰外泌体，使其具有 LSEC 靶向能力。然而，肝脏中大量的巨噬细胞会吞噬外泌体，影响其疗效。CD47 工程化修饰可有效抑制巨噬细胞的吞噬作用，提高外泌体的递送效率。

mRNA 疗法具有广阔的应用前景，但 mRNA 的递送系统仍需进一步优化。本研究通过慢病毒转染制备了 Wnt2 mRNA 富集的外泌体，但未来还需优化 Wnt2 mRNA 的封装策略，以提高治疗效果。此外，本研究在模拟临床场景的实验中发现，工程化外泌体的治疗效果受到肝脏损伤后严重充血的影响，这为后续研究提供了方向。

研究局限性

本研究虽然在 DILI 小鼠模型中取得了一定的治疗效果，但仍存在局限性。目前使用的 DILI 小鼠模型为中度损伤模型，肝脏具有较强的再生能力。为全面评估工程化外泌体的治疗潜力，需要在更广泛的动物模型中进行研究，如致死剂量 APAP 暴露和大面积肝切除术（如 90% 肝切除术）模型。

资源可用性

本研究的主要联系人是 Lin Wang（[e-mail]），研究中产生的所有独特 / 稳定试剂可通过与主要联系人签订材料转移协议获取。转录组数据的原始读取已存入 NCBI 序列读取存档（SRA），登录号为 PRJNA1213977。本文未生成原始代码，所有相关数据均在文章或补充信息中呈现，如需进一步分析数据，可向主要联系人索取。