脂质纳米颗粒包裹 DNA 疫苗：开启免疫新征程

《Cell Reports Medicine》：Modulation of lipid nanoparticle-formulated plasmid DNA drives innate immune activation promoting adaptive immunity

本文介绍了脂质纳米颗粒包裹 DNA（DNA-LNP）疫苗的研究，其能诱导强大免疫反应，有望用于疫苗开发。

　　

在过去数年，核酸疫苗的重要性与日俱增，新的研发路径成为科研焦点。其中，脂质纳米颗粒包裹 DNA（DNA-LNP）疫苗崭露头角，为免疫领域带来了新的曙光。

一、研究背景

疫苗作为对抗病原体的有力武器，能够激发适应性免疫的疫苗意义重大。核酸疫苗，如 mRNA 疫苗和 DNA 疫苗，凭借其独特优势，在近年来备受关注。mRNA 疫苗在 COVID-19 预防中展现出良好效果，像 Moderna 的 SpikeVax（mRNA-1273）和 Pfizer-BioNTech 的 Comirnaty（BNT162b2）已获批使用。不过，mRNA 疫苗在生产和储存方面存在一些挑战，例如需要特定的合成条件和冷链运输。

DNA 疫苗同样具有诸多优点，如临床安全性高、稳定性好且生产简单。然而，裸 DNA 免疫原性较差，传统的脂质纳米颗粒包裹的 DNA 疫苗在体内免疫原性也不理想。在此背景下，研究人员致力于探索新型的 DNA-LNP 疫苗，期望能发挥其优势，克服现有问题。

二、研究内容

1. 脂质与 DNA 比例对免疫原性的影响研究人员考察了不同脂质胺基团与核酸磷酸基团比例（N/P ratio）对 DNA-LNP 的影响。他们制备了表达 CA09 血凝素（HA）的质粒 DNA-LNP（HA DNA-LNP），设置了 10.5、5.3 和 2.6 等不同 N/P 比例。结果发现，10.5 和 5.3 N/P 比例的封装效率相似，而 2.6 N/P 比例的较低。同时，2.6 N/P 比例的颗粒更大，zeta 电位更低。在免疫原性方面，较高 N/P 比例的 HA DNA-LNP 能提升生发中心（GC）内 B 细胞反应，不过细胞毒性 T 细胞和辅助性 T 细胞反应在低 N/P 比例下也能保持稳定。这表明，合适的 N/P 比例对优化 DNA-LNP 的免疫原性至关重要。
2. DNA-LNP 诱导的免疫反应机制
   • cGAS-STING 通路依赖的炎症反应：研究发现，与 mRNA-LNP 和佐剂蛋白相比，HA DNA-LNP 在免疫后能引发强烈的早期炎症反应。通过体外实验，用化学抑制剂处理未免疫的脾细胞后发现，DNA-LNP 激活的先天免疫炎症依赖于 cGAS-STING-TBK1 通路对双链 DNA（dsDNA）的识别，而 Toll 样受体 9（TLR9）对 CpG 基序的识别则并非必需。这揭示了 DNA-LNP 诱导免疫反应的关键机制，为后续研究奠定了基础。
   • 早期免疫激活：免疫后 24 小时，HA DNA-LNP 能显著上调 CD8⁺ T 细胞、CD4⁺ T 细胞和自然杀伤（NK）细胞的早期激活标记 CD69。在髓系细胞群体中，迁移性树突状细胞（mDCs）显著增加，尤其是 CD103⁺ mDCs，而浆细胞样树突状细胞（pDCs）减少，中性粒细胞增多。此外，DNA-LNP 免疫还能诱导所有髓系细胞群体的激活，这一系列变化表明 DNA-LNP 能在近端和远端部位诱导强大的先天免疫激活。
   • 单细胞转录组学分析：通过单细胞 RNA 测序（scRNA-seq），研究人员发现 DNA-LNP 免疫在多个先天免疫亚群中产生了促激活和促迁移的特征。例如，NK 细胞中 Runx3 上调，促进其激活；中性粒细胞中迁移相关基因上调，且 CD244a 下调，减少了髓系来源的抑制细胞；单核细胞和 pDCs 中与免疫细胞迁移相关的基因也上调。这些结果进一步揭示了 DNA-LNP 对先天免疫细胞的调控机制。
3. HA DNA-LNP 诱导的 T 细胞和体液免疫反应
   • T 细胞反应：HA DNA-LNP 诱导的 IFNγ 分泌的 CD8⁺ T 细胞反应比 mRNA-LNP 和佐剂蛋白分别高出 3 倍和 7 倍。在低剂量下，0.2 μg 的 HA DNA-LNP 能诱导与 2 μg mRNA-LNP 相似的 IFNγ 分泌的 CD8⁺ T 细胞反应，展现出良好的剂量节省效应。而在 CD4⁺ T 细胞反应方面，HA DNA-LNP 和 mRNA-LNP 相当，且均显著高于佐剂蛋白。
   • 体液免疫反应：尽管 HA DNA-LNP 诱导的 GC 效应细胞频率低于 mRNA-LNP，但在抗体滴度、广度和功能上，两者相当。HA DNA-LNP 能诱导产生针对流感 HA 的血清抗体反应，与 mRNA-LNP 和佐剂蛋白相比，其产生的血清免疫球蛋白 G（IgG）反应持久，且对不同流感病毒株的结合抗体滴度和血凝抑制（HAI）滴度相似。这表明，DNA-LNP 在体液免疫方面也具有良好的效果。
4. HA DNA-LNP 诱导的记忆反应在小鼠和兔子模型中，HA DNA-LNP 诱导的记忆 T 和 B 细胞反应持久。免疫一年后，HA DNA-LNP 诱导的 IFNγ 分泌细胞反应比 HA mRNA-LNP 或佐剂蛋白高约 4 倍，且能诱导产生大量的效应记忆 CD8⁺ T 细胞。在兔子中，HA DNA-LNP 在免疫后 42 天诱导的 IFNγ 反应比 HA mRNA-LNP 强约 2 倍，且在 202 天内仍能维持较高水平的反应。同时，HA DNA-LNP 和 mRNA-LNP 在兔子中均能诱导产生强大的体液免疫反应，且 HA DNA-LNP 的 IgG 反应更稳定。这些结果表明，HA DNA-LNP 能诱导持久的免疫记忆。
5. SARS-CoV-2 spike DNA-LNP 的免疫效果研究人员构建了表达 SARS-CoV-2 刺突蛋白的 DNA-LNP 和 mRNA-LNP 疫苗。结果显示，Spike DNA-LNP 诱导的针对 SARS-CoV-2 刺突蛋白受体结合域（RBD）的抗原特异性总 IgG 反应与 Spike mRNA-LNP 相当，且对不同变异株的刺突蛋白也能产生竞争性的抗体反应。在中和实验中，Spike DNA-LNP 诱导的中和滴度与 Spike mRNA-LNP 相当。在小鼠攻毒实验中，Spike DNA-LNP 和 mRNA-LNP 均能保护小鼠免受致死性 SARS-CoV-2 攻击，体重无明显下降且全部存活，而空载体对照组小鼠则出现体重下降和高死亡率。这表明，Spike DNA-LNP 具有与 Spike mRNA-LNP 相似的保护效果。

三、研究讨论

本研究对比了 DNA-LNP 疫苗与 mRNA-LNP 和佐剂蛋白的免疫特性。虽然此前 LNP 包裹的质粒 DNA 在体内免疫原性不佳，但本研究发现通过调整 N/P 比例等方式可优化 DNA-LNP 的免疫原性。研究还揭示了 DNA-LNP 诱导免疫反应的机制，包括对先天免疫细胞的激活和调节，以及 T 细胞和体液免疫反应的特点。

不过，研究也存在一些局限性。例如，虽然研究了不同 N/P 比例，但还需进一步探索更多比例及质粒 DNA 磷酸基团对脂质结合的影响；研究主要在小鼠和兔子模型中进行，未来需在更大动物模型中研究剂量递增动力学和耐受性；此外，还需进一步研究 DNA-LNP 在其他免疫部位或黏膜表面的反应，以及与现有递送方式的结合等问题。

总体而言，DNA-LNP 疫苗展现出了强大的免疫原性，在疫苗开发领域具有巨大潜力，有望为预防和治疗多种疾病提供新的策略。未来，随着研究的深入和技术的不断改进，DNA-LNP 疫苗或许能在临床应用中发挥更重要的作用，为人类健康保驾护航。