利用 Prime 编辑平台规模化解析人类遗传变异的功能奥秘

《Cell Genomics》：High-throughput screening of human genetic variants by pooled prime editing

本文构建了 pooled prime editing（PE）平台，可在人类细胞中规模化检测遗传变异功能，助力疾病研究。

　　### 研究背景
在生命科学和健康医学领域，确定遗传变异如何影响功能至关重要，它能为人类疾病的因果关联提供证据，还能改进预测变异效应的计算工具。然而，目前功能证据的缺乏阻碍了人类遗传数据在生物发现和精准医学中的应用，尽管计算预测器性能不断提升，但解读罕见变异，尤其是编码区和非编码区的变异仍极具挑战。

多重变异效应分析（Multiplexed assays of variant effect，MAVEs）为大规模提供变异效应功能证据带来希望，其中基于基因组编辑的技术在检测疾病基因中的功能丧失（loss-of-function，LoF）变异方面表现出色，不过现有方法都存在局限性。饱和基因组编辑（Saturation genome editing，SGE）受同源定向修复（homology-directed DNA repair，HDR）效率低和实验区域限制的影响，可扩展性不佳；碱基编辑筛选虽可扩展性强，但存在编辑限制和脱靶风险。

Prime 编辑（PE）系统理论上能在基因组中安装几乎任何短变异，且近期其在人类细胞中的性能得到显著提升。此前虽有研究利用 PE 进行变异检测，但该技术在大规模功能表征变异方面的潜力仍有待探索，本研究旨在优化 PE 平台，评估其在编码区和非编码区检测多种变异的能力。

研究内容

1. 构建 pooled PE 筛选平台：研究人员创建了稳定表达优化的 Prime 编辑器 PEmax 的单克隆 HAP1 细胞系，同时生成了表达显性负性 MLH1 蛋白（MLH1dn）的 HAP1 细胞系，以增强 PE 效率。为实现高效安装多样化编辑，对关键组件进行优化，包括使用工程化 pegRNA（epegRNA），其通过添加 tevopreQ₁作为 3′ 延伸帽来提高编辑效率；在每个 pegRNA 下游引入 55 bp 的基因组靶序列作为替代靶标（surrogate target，ST），用于评估 pegRNA 编辑效率；采用共选择策略，通过对ATP1A1基因进行编辑使细胞获得对乌本苷（ouabain）的抗性，从而富集编辑细胞。实验结果表明，共选择策略有效提高了编辑细胞的富集率，稳定的 pegRNA 支架（如 F + E 支架）能显著提升 PE 效率，且单核苷酸变异（single nucleotide variants，SNVs）作为单个突变引入时编辑率更高。
2. SMARCB1变异的高通量必需性筛选：SMARCB1编码 BAF 染色质重塑复合物的核心亚基，其失活突变与多种癌症相关，且在 HAP1 细胞中是必需基因。研究人员设计了针对SMARCB1外显子 8 和 9 的 pegRNA 库，涵盖所有可能的 SNVs、多核苷酸变异（multinucleotide variants，MNVs）和 3-bp 缺失。通过深度测序分析 pegRNA 频率和编辑动态，发现 RT 模板（RTT）同源长度、PBS 长度和 PBS GC 含量等 pegRNA 特征与 PE 效率相关。随着培养时间延长，ST 编辑持续增加，且共选择能提高编辑效率。通过计算 pegRNA 分数和变异水平的功能分数，发现高活性 pegRNA 编码的 LoF 变异可通过负选择有效识别，研究还验证了部分 LoF 变异，如 c.1119?12C>G 对剪接的影响，为临床相关变异的解读提供了新依据。
3. MLH1变异效应的准确测定：MLH1是肿瘤抑制基因，其生殖系致病性变异与多种癌症相关，且 ClinVar 中报告了近 2,000 个意义不确定的变异（variants of uncertain significance，VUSs）。研究利用 HAP1 细胞中 MMR 途径功能丧失导致对 6 - 硫鸟嘌呤（6-thioguanine，6TG）部分抗性的特点，通过 6TG 选择对MLH1变异进行正向筛选。设计针对MLH1外显子 10 的 pegRNA 库，在不同细胞系（HAP1:PEmax 和 HAP1:PEmax + MLH1dn）和共选择策略下进行筛选实验。结果显示，通过计算 pegRNA 分数和功能分数，能有效识别 LoF 变异，且功能分数与联合注释依赖的损耗（combined annotation-dependent depletion，CADD）分数相关。对 ClinVar 中报告的非编码MLH1变异进行筛选，发现该平台可识别多种机制导致的 LoF 变异，如影响剪接的变异。通过实验验证了部分变异的功能，为MLH1相关疾病的研究和变异解读提供了重要数据。
4. 平台优势与应用前景：该 PE 平台可在基因组几乎任何位置安装短变异，通过纳入 ST 进行 pegRNA 筛选提高了数据质量。研究为未来在 HAP1 细胞中进行 PE 筛选提供了具体建议，包括延长编辑时间、使用稳定的 pegRNA 支架和纳入 ST 等。随着 PE 试剂和 pegRNA 设计工具的不断改进，该平台有望实现更大规模的筛选，为临床测序中变异的优先级排序和功能研究提供有力支持，还可用于训练和优化预测模型，助力人类疾病相关变异的识别。
5. 研究局限性：目前平台存在一定局限性，部分 pegRNA 编辑效率低，导致变异评分不完全，且假阴性率相对较高。通过更严格的 pegRNA 筛选虽能降低假阴性率，但会减少检测的变异数量。此外，部分变异的功能分数受 MLH1dn 表达影响，对于某些基因外的变异检测，MLH1dn 表达或MLH1敲除可能会干扰结果解读。未来需进一步优化 pegRNA 设计和编辑效率，以提高平台的准确性和覆盖范围。

研究结论

本研究成功构建并优化了 PE 平台，实现了在人类细胞中对编码区和非编码区变异的规模化功能检测，为揭示人类疾病相关变异的功能提供了重要工具，具有广阔的应用前景。尽管目前存在一些局限性，但随着技术的不断发展，有望进一步提升其性能，推动生命科学和健康医学领域的研究进展。