探秘结直肠癌转移 “信使”：循环肿瘤细胞外囊泡的关键作用

《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》：Proteomic profiling and functional analysis of extracellular vesicles from metastasis-competent circulating tumor cells in colon cancer

研究人员为探究结直肠癌（CRC）进展机制，分析 CTC 来源 EVs，发现其与癌症进展相关，意义重大。

　　在癌症研究的神秘领域中，循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）如同隐藏在暗处的 “敌人”，悄无声息地推动着癌症的进展。以往的研究发现，CTCs 在癌症转移过程中扮演着关键角色，然而其具体的作用机制却如同迷雾，让科研人员难以捉摸。

体外 CTC 模型的出现，为揭开这层迷雾带来了希望。但目前对于 CTC 释放的细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）在癌症进展中的作用，以及肿瘤进展与 EV 蛋白质组变化之间的关联，科学界知之甚少。为了深入探索这些未知领域，来自蒙彼利埃大学医学中心等多个研究机构的研究人员展开了一项极具意义的研究。

该研究聚焦于转移性结直肠癌（Metastatic Colorectal Cancer，mCRC）患者来源的 CTC 系所释放的 EVs。研究人员成功建立了一系列独特的 CTC 系，这些细胞系代表了癌症在疾病进展和治疗过程中的克隆进化。通过对这些 CTC 系释放的 EVs 进行深入研究，研究人员发现，不同 CTC 系来源的 EVs 在形态、大小和蛋白质组成上存在显著差异。

研究人员还发现，与治疗前获得的 CTC 系来源的 EVs 相比，治疗失败后获得的 CTC 系来源的 EVs 中，与干细胞特性、内体生物发生和 mCRC 预后相关的蛋白质显著富集，整合素家族蛋白也明显增多。

在体内实验中，研究人员将标记后的 EVs 注入小鼠体内，观察其在不同器官的分布情况。结果显示，EVs 在肝脏中积累最为显著，随后依次是肺、肾和股骨，而在大脑和肠道中未检测到 EVs。这一结果表明，治疗失败后 CTC 系来源的 EVs 对肝脏和肺等器官具有更高的亲和力，可能与癌症的转移潜能密切相关。

该研究成果发表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》上，为理解癌症转移机制提供了新的视角，也为基于液体活检的癌症诊断和治疗监测提供了潜在的生物标志物，具有重要的临床意义。

研究人员为开展此项研究，主要运用了以下关键技术方法：

1. 细胞培养技术：培养了来自 mCRC 患者不同治疗阶段的 CTC 系，包括治疗前（CTC-MCC-41）、第二次复发及二线治疗后（CTC-MCC-41.4）和第三次复发 / 死亡前（CTC-MCC-41.5G），同时以 SW480 和 SW620 细胞系作为对照。
2. EVs 分离与纯化技术：通过多次离心和蔗糖密度梯度离心等方法，从细胞培养上清中分离和纯化 EVs。
3. 蛋白质组学分析技术：利用质谱技术对 EVs 蛋白质进行分析，包括无标记定量（Label-Free Quantification，LFQ）和多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM），鉴定差异表达蛋白。
4. 动物实验技术：将标记的 EVs 经眶后静脉丛注射到 NOD-SCID 小鼠体内，观察其在不同器官的分布情况。

下面来详细介绍研究结果：

1. EVs 特征在不同疾病进展阶段的差异：通过电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析（Nanotracking Analysis，NTA）等技术，研究人员发现不同 CTC 系来源的 EVs 在大小、形态和蛋白含量上存在差异。例如，CTC-MCC-41.5G 细胞来源的 EVs 具有最高的颗粒数与蛋白质量比和最高的颗粒计数。蛋白质组学分析共鉴定出 480 种蛋白质，不同 CTC 系来源的 EVs 有独特的蛋白质组成，且与经典 EVs 相关蛋白相比，CTC 来源的 EVs 中 “外泌体” 成分更为丰富。
2. EVs 蛋白质组学特征：与 Vesiclepedia 数据库对比，发现不同 CTC 系来源的 EVs 蛋白质组存在差异。在治疗失败后获得的 CTC 系（CTC-MCC-41.4 和 CTC-MCC-41.5G）来源的 EVs 中，与 “整合素家族细胞表面相互作用” 通路相关的蛋白质显著富集。此外，通过主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和层次聚类分析发现，CTC 来源的 EVs 可与 CRC 细胞来源的 EVs 区分开，且治疗失败后获得的 CTC 系来源的 EVs 聚类在一起。
3. CTC 来源 EVs 在 NOD-SCID 小鼠体内的生物分布：将标记的 EVs 注射到小鼠体内 24 小时后，研究人员发现不同细胞系来源的 EVs 在器官中的分布和摄取存在差异。CTC-MCC-41.4 和 CTC-MCC-41.5G 细胞来源的 EVs 在肝脏、肺、肾和股骨中的积累显著高于其他细胞系来源的 EVs 和对照组（PBS），而在大脑和肠道中未检测到 EVs。

研究结论和讨论部分指出，本研究首次描述了具有转移能力的 CTC 来源的 EVs 蛋白质组组成，为理解 EVs 在癌症进展中的作用提供了重要依据。研究表明，EVs 蛋白质组的变化与治疗抵抗过程中的克隆进化相关，这可能为液体活检监测癌症进展提供新的方法。然而，研究也存在一定的局限性，如蛋白质组学分析中缺失值的插补方法可能引入偏差，且目前尚未明确这些 EVs 变化在患者体内的实际情况。未来需要更多的体内研究来验证这些发现，进一步探究不同 CRC 亚型的 EVs 相关蛋白谱，以及 CTC 系对化疗药物的反应如何动态改变 EVs 的蛋白质组成。总之，该研究为癌症研究开辟了新的方向，有望为癌症的诊断和治疗带来新的突破。