鸟类皮肤区域特异性的遗传调控机制：HoxC基因簇的关键作用

《SCIENCE ADVANCES》：Skin regional specification and higher-order HoxC regulation

为探究鸟类皮肤区域特异性形成机制，研究人员对波兰鸡等进行研究，发现HoxC基因簇调控皮肤附属器表型。

　　在自然界中，鸟类的皮肤和其附属器呈现出丰富多样的形态，从绚丽多彩的羽毛到独特的鸡冠，这些不同的形态不仅让鸟类在外观上独具特色，还在其生存和繁衍中发挥着重要作用。例如，羽毛可以帮助鸟类保持体温、进行飞行和展示求偶，而鸡冠则在性别识别和竞争中具有重要意义。然而，长期以来，科学家们对于鸟类皮肤区域特异性形成的分子机制却知之甚少，这就像一个神秘的谜题，吸引着众多科研人员去探索。

为了揭开这个谜题，美国南加州大学（University of Southern California）的研究人员开展了一项深入的研究。他们以波兰鸡（Polish chicken，PC）和白来航鸡（White leghorn，WL）等为研究对象，致力于探究鸟类皮肤区域特异性的形成机制。最终，研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上。

研究人员主要运用了多种先进的技术方法。在实验中，他们采用 RNA 测序（RNA-seq）技术，对不同发育阶段和不同身体区域的皮肤样本进行分析，以了解基因的表达情况；利用转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）技术，研究染色质的可及性，从而揭示基因调控的奥秘；通过 Micro-C 实验，研究染色质的三维结构，探究基因在空间上的相互作用。此外，研究人员还利用了 CRISPR-Cas9 基因编辑技术，对特定基因进行敲除或修饰，以验证基因的功能。

研究结果如下：

1. HoxC基因表达沿 WL 皮肤 AP 轴的分布：研究人员通过对 WL 胚胎 9 天（E9）的真皮样本进行 RNA-seq 分析，发现HoxC基因簇在皮肤的不同区域呈现出空间共线性表达模式。在头皮区域，HoxC基因表达较少，而从颈部开始，HoxC4呈现适度表达，HoxC5 - C8、HoxC9 - C10和HoxC11 - C13则分别从背部前部、后部和尾部开始呈现高表达。全组织原位杂交（WISH）和切片原位杂交（SISH）进一步证实了这种共线性分布。此外，研究人员还发现，成年 WL 羽毛毛囊中也保留了这种胚胎期的HoxC表达模式。
2. 共线性HoxC表达与染色质可及性的关系：通过对 E9 头皮、背部前部和尾部真皮进行 ATAC-seq 分析，研究人员发现不同皮肤区域的染色质可及性存在差异。头皮特异性的 ATAC 峰在HoxC簇中缺失，而背部特异性峰位于HoxC簇的 3′端，尾部特异性峰位于 5′端。这些峰属于启动子或其他非编码调控区域，且染色质可及性与HoxC基因表达相关，表明染色质可及性有助于区域特异性HoxC基因表达。
3. WL 中HoxC基因簇的高阶染色质组织具有皮肤区域特异性：Micro-C 实验结果显示，WL 头皮存在一个覆盖整个HoxC簇的特异性 TAD，而背部和尾部则不存在。在头皮中，染色质接触大多发生在 TAD 内，而背部和尾部则有许多染色质环与HoxC簇外部区域相互作用。研究人员还发现，WL 背部和尾部样本中存在一个包含 195 - bp 序列的环锚定，而 PC 头皮中该序列的重复与HoxC10高表达相关，暗示该重复序列可能改变HoxC簇的染色质拓扑结构。
4. HoxC10调控区域的 195 - bp 重复使 PC 头皮中HoxC基因与 TAD 外的区域进行长距离接触：遗传数据表明，PC 鸡冠表型是由HoxC10内含子中的 195 - bp 重复引起的。ATAC-seq 分析显示，PC 鸡冠羽毛的启动子活性更高，且在HoxC基因座上存在两个差异可及区域（DARs），这些区域与转录因子结合，可能参与HoxC基因簇的调控。Micro-C 实验发现，PC 头皮中不存在HoxC簇的 TAD，且有多个与HoxC簇外部区域的染色质环，其中一个环锚定包含 195 - bp 重复序列，可能导致HoxC基因激活。
5. CRISPR-Cas9 介导的 195 - bp 区域缺失抑制 PC 头皮长羽毛生长：为了验证 195 - bp 重复区域的功能，研究人员利用 CRISPR-Cas9 技术删除 PC 基因组中的重复拷贝。实验结果显示，删除该重复序列后，PC 头皮的鸡冠羽毛生长受到抑制，出现异位无羽毛区、小羽毛芽和短羽毛芽等表型，且HoxC6、HoxC8和HoxC10的表达降低，支持了 195 - bp 重复在鸡冠羽毛形成中的作用。
6. HoxC通过MSX2和 Wnt 等信号分子调节羽毛和鸡冠区域的特异性：研究发现，HoxC8在 WL 头皮发育过程中，从 E10 开始在羽毛和鸡冠原基中表达，且其表达水平的变化会影响头皮皮肤区域特异性。通过 RCAS 病毒调节HoxC8表达，发现其可以调节 Wnt 信号通路，影响鸡冠基部区域大小和羽毛形态。此外，研究还发现MSX2和ATF7等分子在HoxC8下游发挥作用，参与头皮命运的决定。
7. ATF7、MSX1和MSX2在 PC 和 WL 鸡冠区域的表达存在显著差异：通过 WISH 和 RNAscope 分析，研究人员发现ATF7、MSX1和MSX2在 PC 鸡冠区域高表达，而在 WL 头部低表达，进一步表明这些分子在调节鸡冠表型中发挥重要作用。
8. HoxC调节成年 WL 头皮羽毛表型：研究人员向成年 WL 头皮羽毛毛囊注射 RCAS - HoxC8，发现可以改变羽毛形态，如缩短羽毛羽片、延长后羽。注射HoxC病毒组合则可以改变羽毛的羽型，扩大绒羽区域，表明成年羽毛毛囊对HoxC和下游基因表达的变化具有可塑性。
9. PC 鸡冠羽毛高表达HoxC：RNAscope 分析显示，PC 鸡冠羽毛中HoxC8和HoxC10的表达水平高于相邻的非鸡冠羽毛和 WL 羽毛，且 RNA-seq 分析发现，PC 鸡冠羽毛中 Wnt 信号通路相关基因和MSX2等基因上调，表明不同的HoxC表达谱和 Wnt 信号活性有助于形成不同的鸡头皮皮肤附属器。
10. 调节 PC 中HoxC8/HoxC10表达调控羽毛长度：向 PC 头部皮肤注射 RCAS - dnHoxC8或dnHoxC10，发现可以抑制鸡冠区域羽毛生长，与 CRISPR - 195 bp 实验结果相似，进一步证实了HoxC8和HoxC10在调节羽毛长度中的作用。
11. HoxC表达模式在不同鸟类中的保守性：研究人员对日本鹌鹑（Japanese quail，JAQ）和加利福尼亚鹌鹑（California quail，CAQ）的研究发现，虽然它们的HoxC基因在躯干区域的表达模式相似，但在头皮区域的表达模式存在差异，表明头皮是一个更具适应性的区域，能够容纳多种HoxC表达模式，从而形成不同的皮肤附属器表型。
12. 195 - bp 序列在不同脊椎动物中的存在情况：通过对 77 种代表性脊椎动物的 DNA 序列分析，研究人员发现 195 - bp 序列仅存在于龟、鳄鱼和鸟类（即主龙类）中，而在鱼类、两栖类、蜥蜴、蛇和哺乳动物中缺失，表明该序列在主龙类进化过程中出现，可能影响HoxC基因簇的调控，进而影响羽毛表型和区域特异性。

研究结论和讨论部分指出，HoxC基因簇的高阶染色质组织具有皮肤区域特异性，TAD 的状态影响HoxC基因的表达，进而决定皮肤附属器的类型。HoxC基因的错误表达会导致皮肤和羽毛的显著变化，在胚胎期可改变皮肤附属器的宏观类型，在成年期则主要影响羽毛的微观形态。此外，研究还揭示了羽毛区域特异性的进化过程，HoxC基因簇在其中发挥了重要作用，但它还需要与其他分子因素相互作用来实现区域特异性。

总的来说，这项研究揭示了鸟类皮肤区域特异性的遗传调控机制，为我们理解鸟类皮肤附属器的发育和进化提供了重要线索。研究结果不仅有助于深入了解鸟类的生物学特性，还为相关领域的研究提供了新的思路和方法，具有重要的科学意义。