敲除 SMAD4 增强自然杀伤细胞抗肿瘤功能：对抗 TGF-β 和激活素 A 抑制的新策略

《Nature Immunology》：Enhancing human NK cell antitumor function by knocking out SMAD4 to counteract TGFβ and activin A suppression

为解决 NK 细胞疗法在实体瘤中疗效受限问题，研究人员敲除 SMAD4，发现可增强 NK 细胞抗肿瘤功能，为癌症免疫治疗提供新途径。

　　在癌症治疗的领域中，自然杀伤（NK）细胞免疫疗法近年来备受瞩目。NK 细胞作为人体免疫系统的重要防线，能够识别并清除肿瘤细胞，在癌症治疗方面潜力巨大。然而，NK 细胞疗法在实体瘤治疗中却面临着重重挑战。肿瘤微环境（TME）中存在的转化生长因子 β（TGF-β）和激活素 A 等抑制性细胞因子，如同 “敌人的陷阱”，严重抑制了 NK 细胞的功能和增殖，使得 NK 细胞难以在实体瘤中发挥其应有的作用，这大大限制了过继性 NK 细胞疗法的疗效。

为了突破这一困境，来自庞培法布拉大学（University Pompeu Fabra）、巴塞罗那医院海洋研究所以及多个国际研究机构的研究人员展开了深入研究。他们将目光聚焦于 SMAD4 基因，试图通过基因编辑的方式来增强 NK 细胞的抗肿瘤能力。最终，研究成果发表在《Nature Immunology》上，为癌症免疫治疗带来了新的希望。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，利用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术，对 SMAD4 基因进行敲除操作。通过从健康供体获取外周血单个核细胞（PBMCs），分离出 NK 细胞并进行基因编辑，实现了对 SMAD4 基因的精准调控。其次，运用多参数流式细胞术对 NK 细胞进行免疫表型分析，能够精确检测细胞表面和细胞内的各种标志物，从而深入了解 NK 细胞的功能和特性。此外，体内异种移植模型的建立也至关重要，研究人员将肿瘤细胞接种到小鼠体内，观察 NK 细胞治疗后的肿瘤生长情况，以此评估 NK 细胞的抗肿瘤效果。

研究结果表明：

1. SMAD4 解耦联 TGF-β 抑制与 NK 细胞组织驻留：通过重新分析微阵列数据发现，TGF-β 可广泛重塑 NK 细胞的转录组，下调 NK 细胞转录因子和效应分子的表达，同时上调肿瘤归巢和组织驻留相关基因的表达。而 SMAD4 在介导 TGF-β 的这些效应中起着关键作用，敲除 SMAD4 可部分阻止 TGF-β 诱导的 NK 细胞激活受体和细胞毒性效应分子的下调，同时保留其组织驻留特性。
2. SMAD4^KONK 细胞功能不受 TGF-β 抑制且增殖能力增强：敲除 SMAD4 的 NK 细胞在转录组和表型上与对照细胞相似，但对 TGF-β 的敏感性显著降低。TGF-β1 暴露会改变对照 NK 细胞的大量基因表达，而 SMAD4^KONK 细胞受影响的转录本明显减少。在功能上，SMAD4^KONK 细胞在 TGF-β1 存在的情况下，仍能维持激活受体和细胞毒性分子的表达，并且其增殖能力不受抑制，在与 IL-2 和 IL-15 联合刺激时，表现出比对照 NK 细胞更强的增殖能力。
3. SMAD4^KONK 细胞具有更强的抗肿瘤活性：在体外实验中，SMAD4^KONK 细胞对结直肠癌细胞系 HCT116 的杀伤能力不受 TGF-β1 的影响，而对照 NK 细胞的细胞毒性则明显降低。在体内实验中，无论是作为单一疗法还是与抗 HER2 抗体联合使用，SMAD4^KONK 细胞在控制 HER2 阳性乳腺癌和结直肠癌的肿瘤生长方面，均表现出优于对照 NK 细胞的效果。
4. SMAD4^KONK 细胞肿瘤浸润和迁移能力增强：TGF-β1 可下调多种黏附分子的表达，而 SMAD4^KONK 细胞对这种下调具有部分抗性，同时保留了对 TGF-β1 介导的组织驻留整合素上调的敏感性。实验表明，SMAD4^KONK 细胞能够更深入地渗透到肿瘤球中，并且在 TGF-β1 存在的情况下，其向趋化因子的迁移能力增强。
5. SMAD4^KONK 细胞比 TGF-β 抑制剂处理的 NK 细胞更具细胞毒性：与使用 TGF-βRI 激酶活性抑制剂 SB-431542 处理的对照 NK 细胞相比，SMAD4^KONK 细胞对 HCT116-GFP+Luc + 球状体的细胞毒性更强，这表明保留 SMAD4 独立的 TGF-β 信号传导对增强 NK 细胞的抗肿瘤功能具有优势。
6. SMAD4^KONK 细胞抵抗激活素 A 介导的抑制：激活素 A 也能抑制 NK 细胞的效应功能，而 SMAD4 参与激活素 A 的信号传导。研究发现，SMAD4^KONK 细胞对激活素 A 介导的抑制具有抗性，在激活素 A 存在的情况下仍能保留其细胞毒性。
7. SMAD4 敲除改善多种临床开发中的 NK 细胞产品的抗 TGF-β 能力：在多种临床开发中的 NK 细胞产品，如抗 CD19-CAR-NK 细胞、脐带血干细胞来源的 NK 细胞（GTA002）和具有适应性特征的外周血 NK 细胞（ADAPT-NK）中，敲除 SMAD4 均能增强它们对 TGF-β 的抗性，且不影响其在稳态条件下的表型和功能。

研究结论和讨论部分指出，SMAD4 在 NK 细胞中起着分子开关的作用，敲除 SMAD4 可将 TGF-β 对 NK 细胞抗肿瘤功能的抑制与其促进组织归巢和驻留的作用解耦联。这一发现为改善 NK 细胞疗法提供了新的策略，尤其是针对实体瘤的治疗。尽管研究取得了重要进展，但仍存在一些局限性，如无法区分 SMAD4^+/–与 SMAD4^–/–NK 细胞的贡献。未来需要进一步研究两者在 TGF-β 丰富环境和体内过继转移过程中的差异。

总体而言，这项研究通过敲除 SMAD4 增强了 NK 细胞的抗肿瘤功能，为基于 NK 细胞的癌症免疫治疗开辟了新的道路，有望为癌症患者带来更有效的治疗方案。