综述：3D 肿瘤培养在临床应用中耐药性及筛选开发研究进展

《Molecular Cancer》：3D tumor cultures for drug resistance and screening development in clinical applications

本文综述了 3D 肿瘤培养技术在耐药研究、药物筛选和个性化治疗中的应用，探讨其前景与挑战。

　　### 肿瘤治疗困境与 3D 培养技术兴起
癌症是全球过早死亡的主要原因之一，其健康负担预计在未来几十年大幅上升。在临床前癌症研究中，开发能可靠模拟患者病情的模型系统是一大挑战。传统二维（2D）肿瘤细胞培养模型虽成本低、效率高，但无法准确复制复杂的肿瘤生理；小鼠模型包括基因工程小鼠模型和患者来源的肿瘤异种移植物（PDX），不仅昂贵、耗时，还存在伦理问题，且对人类疾病的预测价值有限。

相比之下，肿瘤类器官和三维（3D）细胞培养系统作为有前景的替代方案，具有成本和时间优势，能更好地复制肿瘤生理，有望弥合 2D 细胞培养和复杂小鼠模型之间的差距。建立准确的临床前药物筛选模型至关重要，3D 培养技术能更精确地模拟人体生理和疾病状态，提高药物筛选的准确性和效率，还能评估不同药物对肿瘤细胞的影响，为个性化治疗策略提供科学依据。

3D 细胞培养技术

3D 细胞培养技术使细胞生长、分化和组织方式与体内组织相似，能在 3D 空间中生长和相互作用，形成生理相关结构，克服了 2D 培养的局限性，充分发挥肿瘤细胞功能。该技术主要包括以下几种方法：

• 悬滴培养法：通过将细胞悬液滴在培养板底部，利用表面张力使细胞在重力和细胞间粘附作用下聚集形成 3D 结构。此方法操作简单，但细胞悬液体积受表面张力限制，药物处理和形态观察较繁琐，不适用于大规模培养。
• 旋转细胞培养：由细胞培养容器和同轴旋转氧化剂组成，系统旋转时，培养基和细胞均匀分布，细胞在重力、离心力和科里奥利力的共同作用下悬浮并聚集形成 3D 结构。该系统能为细胞提供充足营养和氧气，机械外力小，适合神经细胞生长，且可放大培养体积，用于大规模细胞培养。
• 3D 支架支撑培养：将细胞接种或分散在疏松多孔的支架结构中形成 3D 细胞结构。理想的支架材料应具备无毒、生物相容性好、有一定孔隙率、表面活性良好、可生物降解、可塑性强和机械强度适中等特点。常见的支架材料有凝胶支架和微载体支架等，它们能为细胞提供支持，促进细胞间粘附、增殖和分化。
• 3D 生物打印技术：以细胞、蛋白质和其他生物活性材料为基本单元，通过精确排列这些材料构建体外生物结构、组织或器官模型。该技术可复制细胞外基质（ECM），分析其组成、空间分布和生物学功能，还能直接打印细胞或细胞聚集体，形成有利于细胞生长和功能的微环境。

类器官技术

类器官是通过体外培养自组装形成的 3D 细胞簇，由干细胞分化而来，包含多种细胞类型，具有与真实器官相似的空间结构和功能。根据来源可分为多能干细胞（PSC）来源的类器官和新生儿或成体干细胞（ASC）来源的类器官，其中患者来源的类器官（PDO）在肿瘤研究中应用广泛。

• 3D 肿瘤切片培养模型（3D-TSC）：通过将新鲜肿瘤组织切片嵌入凝胶基质进行组织培养建立模型，可用于高通量药物筛选，能在术后 4 - 7 天内评估个体化药物反应和靶向免疫治疗效果，显著加速精准抗癌治疗的发展。
• 肿瘤类器官（TOs）：通常指 PDO，具有重要的商业潜力。与传统 2D 细胞系相比，TOs 成功率更高、异质性更强，能更有效地复制肿瘤发生和发展过程。虽然 TOs 存在生长速度慢等局限性，但在肿瘤生长、血管生成、耐药性研究以及药物筛选、药物敏感性预测和生物标志物分析等方面具有广泛应用，还可与基因组学、蛋白质组学结合，应用于精准医学和疫苗开发。
• 器官组织芯片：类似于微生理系统（MPSs），是美国食品药品监督管理局（FDA）分类的 MPSs 子类。它包含一个微型化的生理环境，可生成和分析功能性组织单元，模拟特定或靶器官水平的反应。器官组织芯片技术可用于培养类器官，在药物评价中具有独特价值，但目前还不能完全替代传统动物实验，在血管化技术和复制周围神经系统等方面仍面临挑战。

3D 培养技术在药物筛选中的应用

在药物进入临床试验前，需进行严格筛选和评估。传统 2D 肿瘤细胞系和 PDX 模型存在诸多不足，导致药物临床试验成功率低。3D 培养技术能更准确地模拟肿瘤微环境（TME），提高药物筛选的准确性和效率。肿瘤类器官在药物筛选中具有成本低、培养周期短、成功率和转化率高的优势，能有效预测患者对药物的反应，还可用于监测癌症治疗过程中耐药性的进展。

在精准肿瘤学时代，PDO 可模拟药物渗透，广泛应用于药物测试、患者特异性药物测试、靶向治疗和耐药机制研究，为研究肿瘤进化和治疗反应提供了可靠系统，也为测试抗癌药物和个体化癌症治疗提供了新工具。此外，基因编辑技术如 CRISPR/Cas9 可对 PDO 进行基因修饰，结合先进的成像技术，推动药物评价和筛选系统向更全面、精确的方向发展。

3D 培养技术在药理学研究中的应用

• 模拟药物反应：PDO 在模拟药物反应方面具有优势，能更好地反映肿瘤异质性。例如，携带特定基因突变的类器官对相应靶向药物敏感，其基因表达谱可指导药物敏感性筛选。
• 研究药物作用机制：PDO 是研究药物反应机制的重要工具，可在增强肿瘤特异性细胞毒性的同时，尽量减少对正常组织的毒副作用。研究发现 Nrf2 可通过激活 PI3K-Akt-mTOR 信号通路促进肺鳞癌生长，抑制 Nrf2 可降低该信号通路活性，抑制肺鳞癌生长；AXL 抑制剂可通过抑制 SMAD4/TGFβ 信号通路和诱导 JAK1-STAT3 信号通路补偿 AXL 缺失，为肺癌治疗提供了新策略。
• 探索新肿瘤靶点：PDO 可用于识别新的肿瘤靶点，为干预肿瘤进展提供新方法。研究表明，通过在化疗耐药的 PDTO 中使用 Src 或神经酰胺酶抑制剂，可重新激活细胞焦亡，恢复药物敏感性；Kmt2d 基因缺失可导致肺癌发生相关信号通路激活，提示 Kmt2d 是肺鳞癌发生的关键调节因子。
• 药物安全性测试：正常组织类器官可通过细胞毒性测试评估药物对健康组织的毒性。例如，肝类器官可用于研究药物的肝毒性，3D 肝类器官比 2D 模型对药物毒性更敏感，将类器官系统纳入药物筛选和开发测试方法，可提高药物安全性和有效性评估的准确性。

3D 培养模型在耐药性研究中的应用

肿瘤细胞耐药是影响肿瘤治疗效果和患者生存的重要因素，其机制复杂多样。3D 培养技术能模拟肿瘤细胞的体内生长环境，有助于深入研究肿瘤细胞耐药机制，评估不同药物对肿瘤细胞耐药性的影响。

• 耐药机制研究：利用 3D 肿瘤细胞培养模型研究发现，MCF-7 乳腺癌细胞在 3D 胶原培养模型中耐药性显著提高，研究还探讨了 3D 胶原微环境对肿瘤细胞干性、细胞周期和耐药相关 ABC 转运蛋白的影响；癌症干细胞（CSCs）在获得性耐药中起关键作用，其具有强大的 DNA 修复能力、高表达 ATP 结合盒转运蛋白和抗凋亡特性，参与多种信号通路；在结直肠癌中，Wnt 信号通路对肿瘤维持至关重要，特定基因改变可导致 TGF-β 激活，引起转录重编程和谱系逆转，使肿瘤细胞获得新的特性。
• 耐药性筛选：3D 培养模型可用于肿瘤耐药性筛选。研究发现，DNA 甲基转移酶抑制剂地西他滨与苏拉明联合使用，虽不能抑制乳腺癌细胞生长，但可显著降低其侵袭潜力；在研究 PARP 抑制剂（PARPi）对缺乏 BRCA1 或 BRCA2 的肿瘤的作用时，发现 PDO 虽可用于测试 PARPi 敏感性，但可能无法完全模拟肿瘤中的耐药机制；对卵巢癌、子宫内膜癌等肿瘤的研究也表明，3D 培养模型能更准确地反映肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，为筛选有效的治疗方案提供依据。

3D 培养技术临床转化的前景与挑战

尽管 3D 培养技术在耐药研究和临床应用方面取得了一定进展，但仍面临一些挑战，包括 3D 培养方法的标准化、肿瘤类器官缺乏临床批准、细胞模型复杂和培养成本高等问题。未来，3D 培养技术可能会与基因组学、单细胞分析等新兴技术结合，为药物筛选和耐药性预测提供更准确的方法。

肿瘤类器官为个性化治疗提供了新途径，可预测药物疗效和预后，但肿瘤内异质性会影响类器官建立和药物敏感性预测的准确性。此外，肿瘤类器官缺乏肿瘤基质相互作用和 TME，限制了其临床应用。为解决这些问题，研究人员尝试将类器官与肿瘤基质细胞、免疫淋巴细胞等共培养，以模拟更真实的体内环境。人工智能（AI）技术在类器官研究中的应用，如 3D 类器官图像分析，有望提高研究的准确性和效率，加速类器官向临床实践和精准治疗的转化。

结论与展望

3D 培养系统和肿瘤类器官有望捕捉肿瘤异质性，评估药物反应的变化，但体外敏感性与患者最终结局之间的相关性尚未建立。开发 3D 培养系统及其培养和分析方法仍面临诸多挑战，但 3D 培养技术具有很强的体内模拟潜力，为基础癌症研究和临床癌症治疗搭建了桥梁，有望为优化肿瘤治疗策略和精准治疗提供基础。

个性化癌症医学需要合适的患者肿瘤模型，肿瘤类器官为此提供了有前景的平台。未来，需要改进培养方法，减少类器官生成时间，降低成本，确保材料供应；整合 CRISPR/Cas9 技术进行基因编辑，调控类器官特定表型；构建包含患者来源的癌症相关成纤维细胞（CAFs）、免疫细胞、毛细血管系统和生物力学刺激的共培养系统，以更好地模拟疾病进展和演变，建立体外敏感性与患者最终结局之间的联系，推动肿瘤类器官技术在基础癌症研究和临床癌症治疗中的进一步发展。