血小板糖蛋白 VI 与肾小管上皮细胞来源的半乳糖凝集素 - 3 相互作用促进叶酸诱导的急性肾损伤

《Cell Communication and Signaling》：Platelet glycoprotein VI promotes folic acid-induced acute kidney injury through interaction with tubular epithelial cell-derived galectin-3

研究人员探究叶酸诱导的急性肾损伤（FA-AKI）中血小板功能，发现 Galectin-3 与 GPVI 相互作用加重损伤，或为治疗提供新策略。

　　急性肾损伤（Acute kidney injury，AKI）是一种常见的临床病症，就像肾脏突然遭遇了一场 “风暴”。在这场 “风暴” 中，肾功能会显著下降，不仅会影响身体的凝血功能，还会激活炎症免疫反应，对肾小管上皮细胞（Renal tubular epithelial cells，TECs）造成严重损害。尽管医学研究在不断进步，但 AKI 的发病率却仍在持续上升。

目前，AKI 发病机制中一个关键的谜团尚未解开：受损的肾小管上皮细胞如何通过血小板引发肾脏炎症？血小板在炎症和凝血过程中都起着重要作用，血小板糖蛋白 VI（Glycoprotein VI，GPVI）作为血小板表面的关键受体，在血小板激活过程中扮演着至关重要的角色。此前研究发现，GPVI 在横纹肌溶解诱导的 AKI 中会被激活，促进肾脏巨噬细胞中细胞外陷阱的形成。同时，肿瘤细胞产生的半乳糖凝集素 - 3（Galectin-3）能与血小板 GPVI 结合，促进肿瘤转移。Galectin-3 在 AKI 中也有高表达，与肾脏损伤严重程度相关，但它是否会通过与 GPVI 相互作用加重肾脏负担尚不清楚。

为了揭开这些谜团，华中科技大学同济医学院的研究人员开展了一系列研究。他们的研究成果发表在《Cell Communication and Signaling》上，为 AKI 的治疗带来了新的希望。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。他们构建了小鼠模型，包括 GPVI 敲除小鼠和正常小鼠，通过腹腔注射叶酸诱导 FA-AKI。利用免疫荧光染色技术，他们能够直观地观察到肾脏组织中血小板和免疫细胞的浸润情况；通过 Western blot 技术，对相关蛋白的表达和磷酸化水平进行检测，从而深入了解信号通路的激活情况；此外，还运用了流式细胞术，分析细胞的表型和功能变化。

研究结果如下：

1. 血小板在 AKI 中活性增强：研究人员通过腹腔注射叶酸建立 FA-AKI 小鼠模型，发现注射叶酸 24 小时后，小鼠病情恶化，肾脏组织出现肾小管上皮细胞死亡、刷状缘消失和肾小管扩张等现象，肾小管损伤评分显著升高，血尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（Serum creatine，CRE）水平以及肾脏与体重比值均增加，表明模型构建成功。进一步检测发现，FA-AKI 小鼠肾脏中血小板特异性标记物 CD41 的染色显示血小板浸润增加，血小板表面 P - 选择素（CD62P）表达显著升高，血小板聚集和颗粒释放能力增强，凝块回缩和血小板铺展能力也明显提高，这些结果表明血小板在 AKI 中表现出更强的激活能力。
2. AKI 中血小板 GPVI 表达增加：研究人员通过流式细胞术和 Western blot 检测发现，FA-AKI 小鼠血小板膜上 GPVI 的表达水平显著高于正常小鼠，其下游信号分子 PLCγ₂和 Syk 的磷酸化水平也明显升高，这表明在 AKI 过程中，血小板 GPVI 表达上调且其下游信号通路被激活，提示 GPVI 可能在疾病进展中发挥关键作用。
3. GPVI 敲除减轻叶酸诱导的 AKI：利用 GPVI 敲除小鼠进行实验，结果显示，GPVI 敲除小鼠在 FA-AKI 后，肾脏损伤和胶原蛋白积累明显减轻，CRE 和 BUN 水平降低，肾功能得到改善。同时，肾脏中肾小管损伤标志物 NGAL 的蛋白和 mRNA 水平下降，肾细胞凋亡减少，TUNEL 检测阳性区域显著缩小，表明 GPVI 的缺失对 FA-AKI 具有保护作用。
4. TECs 来源的 Galectin-3 通过 GPVI 途径诱导血小板激活：免疫组化染色发现，FA-AKI 小鼠肾脏中 Galectin-3 水平显著高于正常小鼠，ELISA、q-PCR 和 Western blot 结果也证实了这一点。免疫荧光染色进一步显示，在 FA-AKI 过程中，肾 TECs 高度表达 Galectin-3。体外实验中，用损伤的肾细胞（DTEC）上清刺激小鼠血小板，发现 DTEC 上清能以剂量依赖的方式增强血小板 P - 选择素的表达，且这种作用可被 Galectin-3 抑制剂乳糖抑制。此外，Galectin-3 刺激可诱导小鼠血小板酪氨酸磷酸化，SFK 抑制剂 PP2 和抗 GPVI 抗体 JAQ1 F (Ab)₂能显著抑制 Galectin-3 诱导的 Syk 和 PLCγ₂信号通路的磷酸化，表明 Galectin-3 可通过与血小板 GPVI 相互作用诱导血小板激活并触发其下游信号通路。
5. GPVI 与 Galectin-3 的相互作用增加 AKI 中的 MPA：通过流式细胞术检测发现，FA-AKI 小鼠血液中单核细胞 - 血小板聚集体（Monocyte-platelet aggregation，MPA）（以 Ly6C⁺CD41⁺双阳性门亚群为特征）显著增加，且 Ly6C⁺CD41⁺细胞群与血浆 Galectin-3 水平显著相关。用血小板 GPVI 特异性抑制剂 JAQ1 F (Ab)₂处理后，AKI 小鼠的 MPA 水平显著下降。在 GPVI 敲除小鼠和同窝对照小鼠的实验中，重组 Galectin-3 蛋白刺激后，同窝对照小鼠全血中 MPA 水平显著升高，而 GPVI 敲除小鼠中 MPA 水平显著降低，表明 Galectin-3 与血小板 GPVI 相互作用促进了 FA-AKI 中 MPA 的形成。
6. GPVI-Galectin-3 相互作用使单核细胞极化为 M1 促炎巨噬细胞：在 Transwell 迁移实验中，发现有 Galectin-3 存在时，Gp6^+/+组的 Raw264.7 细胞穿过聚酯膜的数量比 Gp6^-/-组更多。将血小板与单核细胞在有或无 Galectin-3 的情况下共培养后发现，Gp6^+/+-PLT + Galectin-3 组促进了单核细胞向 M1 型巨噬细胞分化，表现为 CD86 水平升高、CD206 水平降低，而血小板 GPVI 敲除则逆转了这种效应。此外，用巨噬细胞条件培养基刺激小鼠脑微血管内皮细胞（bEnd.3）的伤口愈合实验和 FITC 标记的葡聚糖吞噬实验也表明，GPVI-Galectin-3 相互作用抑制了巨噬细胞向 M2 型极化，促进了 M1 型巨噬细胞的吞噬活性，说明 Galectin-3 与血小板 GPVI 的相互作用促进了单核细胞向 M1 促炎表型极化。
7. MPA 诱导肾 TECs 凋亡和 DNA 损伤：将 Raw264.7 细胞与血小板在有或无 Galectin-3 的情况下共培养 24 小时，收集条件培养基培养肾 TECs（TCMK-1）。流式细胞术和 TUNEL 染色显示，添加 Galectin-3 后，TCMK-1 细胞的凋亡率显著增加。Western blot 分析表明，Galectin-3 激活的血小板上清与 Raw264.7 细胞共培养后，TCMK-1 中促凋亡蛋白 Bax 的表达增加，抗凋亡蛋白 Bcl2 的水平降低。免疫荧光和 Western blot 结果还显示，与对照组相比，Galectin-3 存在时血小板与 Raw264.7 细胞共培养的上清诱导了 TCMK-1 的 DNA 损伤，表明 MPA 的形成可驱动 AKI 的进展。
8. 阻断 Galectin-3-GPVI 相互作用减少血小板和巨噬细胞浸润并减轻 AKI：在叶酸诱导的 GPVI 敲除小鼠模型和同窝对照小鼠中，研究人员使用 Galectin-3 抑制剂 TD139 进行干预。结果显示，TD139 处理和 GPVI 敲除组小鼠的生存时间显著延长，BUN、CRE、肾小管损伤和胶原蛋白沉积均得到改善，但 GPVI 缺失与 TD139 联合治疗并未进一步改善肾功能。免疫荧光分析显示，抑制 Galectin-3 与血小板 GPVI 的相互作用后，小鼠肾脏组织中 CD41 血小板和 CD68 巨噬细胞的浸润减少，肾脏组织中炎症因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的 mRNA 水平相应降低，表明阻断 Galectin-3 与血小板 GPVI 的相互作用可减轻肾脏负担，缓解 AKI。

研究结论和讨论部分指出，本研究揭示了 Galectin-3 与血小板 GPVI 的相互作用在 AKI 病理生理过程中的重要作用。受损肾 TECs 释放的 Galectin-3 与血小板 GPVI 相互作用，激活血小板，促进 MPA 形成，驱动巨噬细胞向 M1 表型转换，加重肾脏炎症和组织损伤。遗传缺失 GPVI 或应用 Galectin-3 抑制剂 TD139 可改善 AKI，这为 AKI 的治疗提供了新的潜在治疗策略，有望通过干预 Galectin-3-GPVI 相互作用来减轻肾脏损伤，改善患者预后。