综述:纳米技术助力的 CRISPR/Cas 系统:在痕量癌症相关核酸生物传感领域的破冰之旅

【字体: 时间:2025年03月15日 来源:Molecular Cancer 27.7

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  ### 引言
癌症作为全球主要死因,严重威胁人类生命健康。早期检测对提高癌症患者生存率至关重要,传统蛋白质生物标志物检测存在不足,核酸类癌症生物标志物(NABCBs)的出现为癌症早期检测带来新契机。然而,NABCBs 在复杂生物样本中丰度低,传统检测方法难以满足需求。
CRISPR/Cas 系统是一种强大的核酸检测工具,具有核酸靶向性、可编程性、序列特异性等优势。纳米技术的发展为生物传感带来新变革,纳米材料在信号生成、放大、转换及样本提取分离等方面表现出色。将纳米技术与 CRISPR/Cas 系统结合,有望实现对痕量 NABCBs 的简单、准确、无创检测,在癌症早期检测和监测等方面具有广阔应用前景。

癌症相关核酸生物标志物


传统癌症生物标志物检测依赖抗体免疫分析,存在劳动强度大、灵敏度和特异性低等问题。NABCBs 可从血液、尿液等体液中获取,具有高效、特异、无创等优点。其主要类型包括 RNA、DNA 和单核苷酸突变。

癌症相关 RNA 生物标志物中,miRNA 和长链非编码 RNA(lncRNA)研究广泛。miRNA 是长度为 15 - 25 个核苷酸的非编码单链 RNA,通过 RNA 诱导沉默复合体(RISC)介导基因转录后调控。如 miRNA - 21 在多种癌症的发生、发展中起重要作用,miRNA - 155 参与癌症进展的调控,let - 7 家族 miRNA 下调与癌症抑制相关。lncRNA 长度超 200 个核苷酸,可作为癌基因或抑癌基因,通过与 miRNA 相互作用调节基因表达,如 lncRNA HOXC13 - AS 与宫颈癌患者预后相关,CTBP1 - AS2 通过海绵作用影响宫颈癌发生发展。

癌症相关 DNA 生物标志物主要包括循环游离 DNA(cfDNA)和循环肿瘤 DNA(ctDNA)。cfDNA 是血液循环中部分降解的内源性双链 DNA,ctDNA 是与癌症相关的非侵入性生物标志物,其突变可反映癌症的基因组特征,在癌症早期诊断、监测和预后评估中具有重要意义。

癌症相关单核苷酸突变生物标志物包括 DNA 甲基化和点突变。DNA 甲基化是 DNA 的化学修饰,异常甲基化与癌症发生密切相关,如癌症抑制基因启动子区的高甲基化可导致基因沉默。单核苷酸突变(SNV)和单核苷酸多态性(SNP)涉及 DNA 序列中单核苷酸的变化,对遗传病理学、药理学和遗传诊断具有重要意义,但传统检测方法存在困难。

目前,NABCBs 相关商业产品不断涌现,基于不同技术平台和检测指标,为癌症早期筛查提供支持。如 DNA 甲基化检测试剂盒已广泛应用于临床,部分 cfDNA 和 ctDNA 产品专注于肝癌早期检测,miRNA 检测试剂盒也有一定市场,但在临床应用中,cfDNA、ctDNA 和甲基化检测已得到认可,miRNA 检测尚未广泛普及。

CRISPR/Cas 工具箱


CRISPR/Cas 系统是细菌和古菌的天然免疫防御系统,由编码 Cas 蛋白的基因和 CRISPR 阵列组成。其作用机制包括外源 DNA 捕获、crRNA 合成和靶向干扰。CRISPR/Cas 系统主要分为两类,其中 Cas9、Cas12、Cas13 和 Cas14 属于第 2 类,在基因编辑和分子诊断中应用广泛。

CRISPR/Cas 分子诊断技术利用其特异性和高效切割活性实现对特定核酸的高灵敏检测。Cas9 是 V 型 CRISPR 效应蛋白,通过 sgRNA 引导识别 PAM 序列进行顺式切割,基于此开发的核酸序列扩增 CRISPR/Cas9(NASBACC)技术用于分子诊断。Cas12a 和 Cas13 具有反式切割活性,结合等温核酸扩增方法,开发了 DETECTR、SHERLOCK 等核酸检测技术。Cas14 可区分 SNP,虽目前在 NABCBs 检测中的应用报道较少,但具有潜在应用价值。

纳米材料集成生物传感


纳米技术的发展推动了纳米材料在生物传感分析中的应用。纳米材料在简化样本提取分离、改善信号生成转导、加速分子识别反应等方面发挥重要作用,可作为信号发生器、增强器、转换器和样本提取反应容器。

作为信号发生器,纳米材料可提供荧光、比色、磁性、光热等信号。荧光纳米颗粒如量子点(QDs)、上转换纳米颗粒(UCNPs)等在核酸检测中具有优势;金纳米颗粒(AuNPs)、磁性纳米颗粒(Fe3O4)等可产生比色信号;Fe3O4还可作为信号可视化剂;AuNPs、金纳米棒(AuNRs)等可产生热信号。

纳米材料作为信号增强器,可显著放大痕量检测生物标志物的微弱信号。其大比表面积便于标记活性物质或信号分子,如利用 AuNPs、二氧化硅纳米颗粒(SiO2NPs)等作为复合载体增强信号,还可通过表面拉曼增强、电化学增强等进一步提高灵敏度。

纳米材料可实现信号转换,如纳米酶催化和荧光共振能量转移(FRET)。纳米酶可催化底物产生颜色变化或化学发光,MOFs 可作为信号转换器,AuNPs 等可催化鲁米诺化学发光。FRET 系统利用具有荧光特性的纳米材料作为能量供体实现生物标志物检测。

纳米材料还可作为样本提取或反应容器,如 Fe3O4可用于核酸提取和富集,功能化纳米颗粒可快速捕获目标,空心和金属纳米材料可作为理想反应容器,DNA 纳米颗粒如纳米花(DNF)等在癌症体外检测中发挥重要作用。

基于 CRISPR 的 NABCBs 检测生物传感


NABCBs 在癌症发生发展中起重要作用,但由于其不稳定、动态表达变化和低丰度等特点,检测困难。基于 CRISPR 的诊断(CRISPR - Dx)具有高特异性和灵敏度,结合纳米技术可实现对痕量 NABCBs 的高效富集、信号放大和精准检测,为癌症早期无创组织活检和精准治疗提供支持。

无扩增 CRISPR 用于 NABCBs 检测


无扩增 CRISPR 检测技术具有检测时间短、操作简单、成本低等优势。在 RNA NABCBs 检测方面,CRISPR/Cas13a 可实现对 miRNA 和 lncRNA 的直接无扩增检测。如通过设计串联 CRISPR/Cas13a/Cas12a 直接生物传感器、基于等离子体增强荧光免疫分析的方法等实现对特定 miRNA 和 lncRNA 的检测,还可利用 CRISPR/Cas13a 的反式切割能力实现多个 miRNA 的同时检测。

在 DNA NABCBs 检测方面,通过设计 CRISPR/Cas 复合物识别特定癌症相关 DNA 序列,无需预扩增目标序列。如开发的 Cas12a 介导的未扩增数字 DNA 检测方法用于血浆中 cfDNA 的检测,缩短了检测时间并提高了检测准确性。

对于点突变 NABCBs 检测,无扩增 CRISPR 技术也有应用。如通过引入特定核苷酸错配和 PAM 序列构建系统,可提高反应灵敏度和特异性,区分野生型和突变型。此外,还可利用 CRISPR/Cas12a 结合甲基化敏感限制性内切酶(MSREs)检测单个 CpG 位点的甲基化水平。

等温扩增集成 CRISPR 用于 NABCBs 检测


等温扩增技术可在恒温下实现核酸扩增,简化设备要求和操作复杂性。将 CRISPR 与等温扩增技术结合,可进一步提高检测灵敏度和准确性,实现双层信号放大。

在 RNA NABCBs 检测中,目前主要通过将 RNA 靶标转化为相应的单链或双链 DNA 序列,激活 Cas 的反式切割活性进行检测。如设计催化发夹 DNA 电路(CHDC)结合 Cas13a 检测与非小细胞肺癌(NSCLC)相关的 RNA,开发颜色 imetric 生物传感检测系统检测 miRNA - 10b 等。此外,CRISPR 与等温扩增结合还可用于 lncRNA 检测,如通过设计模块化组件实现对 lncRNA pacer 的特异性检测。

在 DNA NABCBs 检测方面,结合 CRISPR 系统与等温扩增技术,利用 Cas 引导 crRNA 识别 PAM 序列或 PFS 序列,实现对癌症样本中 DNA 的快速扩增和检测。如开发的基于 Cas12a 的荧光生物传感结合杂交链式反应(HCR)检测痕量 ctDNA 片段,设计的荧光信号系统检测 ctDNA 中的 T790M 突变等。

在点突变 NABCBs 检测中,基于荧光探针的研究取得进展,如开发的结合指数扩增反应(EXPAR)和 Cas12a 的荧光生物传感用于检测 DNA 甲基转移酶。此外,纸基生物传感在 DNA 甲基化检测中得到应用,如基于侧向流动分析(LFA)的方法可实现对甲基化 DNA 的肉眼识别。

纳米材料辅助 CRISPR 用于 NABCBs 检测


纳米材料独特的理化性质使其在生物分子诊断中具有显著优势,可提高 CRISPR/Cas - based 分子生物传感的检测性能。

在 RNA NABCBs 检测中,虽相关报道有限,但已有研究利用修饰的电极检测 lncRNA,如用金纳米笼和酰胺化多壁碳纳米管修饰的丝网印刷碳电极检测 lncRNA MALAT1。此外,基于 AuNP 的纳米信标、量子点 - DNA 水凝胶等可用于 miRNA 检测,纳米片作为反应容器或信号发生器也可提高检测灵敏度。

在 DNA NABCBs 检测方面,纳米材料主要用于增强荧光信号或作为电化学传感的载体。如设计的基于 Cas12a 的金属增强荧光核酸扩增生物传感检测 cfDNA 中的基因,开发的基于纳米材料的电化学生物传感用于 cfDNA 和 ctDNA 检测,包括基于石墨烯的微针贴片、三维纳米结构等。

在点突变 NABCBs 检测中,石墨烯等纳米材料因其高比表面积和优异的导电性被广泛应用。如利用石墨烯单层效应晶体管、基于 Cas12a 的石墨烯场效应晶体管(gFET)阵列等检测 SNP。

挑战与展望


基于 CRISPR 的纳米生物传感在癌症早期检测中展现出巨大潜力,但仍面临一些挑战。多靶点检测和体液样本的复杂性带来背景干扰问题,影响检测准确性;缺乏标准化检测方法和相关临床指南,限制了其临床应用;商业产品的突破和实现及时诊断、连续监测的需求有待满足,需要设计更灵敏、便携、易用的集成生物传感;部分纳米材料存在活性 / 稳定性低、分散 / 均匀性差和潜在环境毒性等问题。

针对这些挑战,可采取以下措施:探索基于新型可编程核酸酶和纳米平台的生物传感技术,优化样本预处理步骤,开发更合理的 CRISPR 引导 RNA(gRNA)算法;整合遗传学、表观遗传学等数据,制定个性化检测方案,建立癌症生物标志物识别标准;将免疫生物传感、生物芯片、纳米孔测序和人工智能辅助图像分析等技术集成到便携式设备中,促进连续实时检测和商业化;通过物理化学方法改善纳米材料的性能,采用绿色合成方法降低其潜在毒性。

结论


本文全面综述了 NABCBs 的发展过程、类型、致癌机制和商业化产品,深入探讨了 CRISPR/Cas 工具箱的功能和纳米材料的特性,以及基于 CRISPR 和纳米技术的不同 NABCBs 生物传感应用。CRISPR - based 平台结合等温扩增和纳米材料在生物分析和疾病诊断中表现出高灵敏度和选择性。尽管在 NABCBs 检测中仍存在挑战,但通过探索新兴生物传感技术、优化样本预处理、制定个性化策略、集成便携式设备和改进纳米材料等措施,有望克服这些困难,为癌症诊断、早期疾病检测和人类健康带来新的希望。

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