开发顺式调控元件的鉴定、表征和分子编辑

在aBIOTECH上发表的一篇论文中，作者开发了一种管道来识别、表征和编辑CRE，并进一步操纵基因的表达模式以及由此产生的表型。

　　

本研究由Zixian Zeng教授牵头（四川师范大学生命科学学院生物科学系）。作者开发了一种管道来识别、表征和编辑这种CRE，并进一步操纵基因的表达模式以及由此产生的表型。该管道包括四个主要步骤，包括：1)使用开放染色质策略，通过DNA-seq， MNase-seq或ATAC-seq检测CREs的全基因组预测；2)利用荧光素酶（LUC）报告系统瞬时转化烟草中候选CREs的快速功能验证；3)利用β-葡萄糖醛酸酶（GUS）报告系统评价植物cre的活性和组织特异性；4) CREs基因组编辑、靶基因表达评估及表型分析。

以StCDF1为例。为了确定StCDF1的核心启动子区域，作者利用先前从DM 1-3叶片组织中构建的DNA-seq文库，检测到位于该基因上游和5'UTR区域的288 bp dna酶I超敏位点（DHS），命名为T# 01。在烟草瞬态试验和遗传转化中，T# 01与启动子活性相关，主要分布在马铃薯幼苗的叶、茎和根中。此外，启动子t# 01在SD下比LD更活跃，这与StCDF1的表达模式一致。为了进一步评估T#01在体内的调节作用，作者生成了一条纯合子CRISPR/Cas9编辑的细胞系，其中有两个缺失（10 bp和5 bp）。StCDF1在野生型（WT）和纯合子CRISPR/ Cas9编辑系（T#01）中的表达模式在LD和SD条件下的昼夜波动相似。有趣的是，在LD和SD条件下，CRISPR/Cas9编辑的细胞系T#01在这些时间点显示出明显较低的StCDF1水平。此外，T# 01基因的缺失在LD和SD条件下均延迟了结核形成时间，LD条件下约为6天，SD条件下约为5天。T#01基因的缺失导致LD条件下开花延迟，SD条件下生物量减少。

在此基础上，作者确定了StCDF1的288 bp核心启动子区域，该区域具有光周期诱导性。核心启动子的基因组编辑显示，在长昼和短昼条件下，表达水平降低并导致晚期结核。这个管道提供了一种替代方法来改善特定性状，对其他表型不利。

Developing a pipeline for identification, characterization and molecular editing of cis-regulatory elements: a case study in potato