水生所在斑马鱼肠黏膜免疫细胞分析方法上取得新进展

　　

　　在水产养殖中，饲料引起肠黏膜慢性炎症的情况尤为常见，同时肠黏膜免疫屏障也经常是水产病源（如病毒、细菌等）入侵的首当其冲的位置。因而，对于鱼类肠炎的研究已成为最近水产疾病的基础研究热点。 

　　目前，斑马鱼已成为肠粘膜免疫研究的常见模式动物，应用于疾病建模以及药物筛选。中国科学院水生生物研究所鱼类功能基因组学学科组科研人员利用斑马鱼开发了一整套肠炎研究体系，包括幼鱼的固有免疫阶段和适应性免疫阶段的肠黏膜免疫细胞成像分析方法^{[1, 2]}，以及成鱼的豆粕诱导肠炎（SBMIE）的病理和多组学分析方法。基于斑马鱼食源性肠炎模型，进行了一系列水产药物开发^[3,4,5]。但是，关于药物在鱼体内起效的免疫机理的深入解析，还需要对成鱼肠粘膜免疫在细胞水平上的研究进行方法上的突破。 

　　近日，该团队创新了斑马鱼肠黏膜免疫细胞悬液的制备操作方法，开发了一套快速简单的操作方法，用于制备来自肠粘膜的免疫细胞悬液。通过反复吹打，可将肠绒毛肌层以上部分的免疫细胞分离出来（图1）。与经济鱼常用的网搓法相比，吹打法对斑马鱼黏膜组织细胞活性的损失较小。再采用流式细胞术，结合荧光标记免疫细胞的分门策略，可精确分离斑马鱼肠黏膜免疫细胞群中的各种免疫细胞类群，包括中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等。本方法是对于斑马鱼肠黏膜炎症模型的有效技术补充，可更好地在细胞水平探究斑马鱼肠黏膜免疫的机理。 

图1 粘膜免疫细胞悬液的制备操作图解

　　在荧光显微镜下观察斑马鱼肠黏膜细胞悬液细胞，发现结团率较低，多数粒径在10μm左右。采用免疫细胞荧光标记的斑马鱼品系来分离，发现AO/PI染色后，与传统的网搓法相比，流式细胞术检测所得细胞活性大幅提高，细胞基本无粘连，荧光表达和细胞形态均良好（图2）。对肠组织和处理后剩余部分进行切片观察发现，处理后仅剩肌层与浆膜层，而上皮层与固有层已不可见，暗示其中细胞已被制为悬液。而qPCR和转录组分析均能进一步证明分离细胞的组成。结果表明分离细胞组的免疫细胞标记基因表达量显著高于肠组织本身，而MUC基因表达热图也表明在分离细胞组优势表达的为内层黏蛋白基因；KEGG富集分析也在分离细胞组中发现大量免疫相关通路。 

图2 荧光标记的肠黏膜免疫细胞的流式细胞术分析表明本方法在细胞活性和得率上具有优势

　　进一步，对目前的吹打法制备的细胞悬液及其流式细胞术进行了应用。在对各类型的免疫细胞（荧光标记）进行了流式细胞术分析，与网搓法比，吹打法能显著提高肠黏膜来源的细胞悬液中免疫细胞的得率；而对其他免疫组织（外周血、头肾、脾脏、肝脏）来源的细胞悬液的对比分析，发现肠免疫细胞比例符合鱼类免疫细胞的正常分布比例。通过吹打法在斑马鱼SBMIE肠炎模型中的应用分析，表明该方法能够准确反映肠炎相关免疫细胞比例变化（图3）。 

　　因此，目前在斑马鱼中开发的肠黏膜免疫细胞悬液制备及分离分析的方法，提供了研究模式鱼类的肠黏膜免疫细胞的实用技术。本方法可应用于水产肠炎病理研究，即病源或者食源中的抗原、抗营养因子等引起的黏膜屏障功能失调，乃至经肠吸收的饲料添加的功能成分或替抗药物（如功能性植物成分或中草药）的抗病效果评价，可对其在维持肠粘膜免疫稳态中的作用进行细胞水平的机制解析。另一方面，对于医学基础研究中的结肠炎斑马鱼模型来说，化学物质DSS、TNBS等诱导的克罗恩病（Crohn’s Disease, CD）、溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）的模型，本方法也适用，可提供在细胞水平上的研究手段支持。 

图3 本方法在斑马鱼SBMIE模型中对免疫细胞的分析应用

　　本研究是在吴南副研究员主持的中国科学院江西产业技术创新与育成中心科技支撑产业发展计划项目“水产替抗功能植物筛选与渔用技术研发”（ZKYJXZXCY-202210）、以及国家自然科学基金面上项目（31872592）的共同资助下，由硕士研究生赵旭阳、刘宇航、谢家元等人共同完成，夏晓勤研究员和吴南副研究员为共同通讯作者。相关研究成果在Frontiers in Immunology杂志发表（DOI: 10.3389/fimmu.2023.1193977），题为《The manipulation of cells suspension from zebrafish intestinal mucosa contributes to understanding enteritis》，收录于鱼类黏膜免疫研究的热点专题“Mucosal Barrier in Teleost Fish: Physical Biochemical and Immune Nature”。 

　　  

　　参考文献： 

　　1. 黎明，谢家元，李晓敏，王锐，单俊玮，赵旭阳，程莹寅，张婉婷，吴南*，夏晓勤*. 斑马鱼食源性肠炎模型及其免疫细胞成像分析方法的建立. 水生生物学报，2022，46（2），1-12. 

　　2. M Li, X Zhao, J Xie, X Tong, J Shan, M Shi, G Wang, W Ye, Y Liu, BH Unger, Y Cheng, W Zhang, N Wu* and X-Q Xia*. Dietary Inclusion of Seabuckthorn (Hippophae rhamnoides) Mitigates Foodborne Enteritis in Zebrafish Through the Gut-Liver Immune Axis, Frontiers in Physiology, 2022, 13, 831226. 

　　3. J Xie, M Li, W Ye, J Shan, X Zhao, Y Duan, Y Liu, BH Unger, Y Cheng, W Zhang, N Wu* and X-Q Xia*. Sinomenine hydrochloride ameliorates fish foodborne enteritis via α7nAchR mediated anti-inflammatory effect whilst altering microbiota composition, Frontiers in Immunology, 2021, 12, 766845. 

　　4. N Wu*, X Xu, B Wang, XM Li, YY Cheng, M Li, XQ Xia and YA Zhang. Anti-foodborne enteritis effect of galantamine potentially via acetylcholine anti-inflammatory pathway in fish. Fish and Shellfish Immunology, 2019, 97, 204-215.