人为什么会发烧？看院士庄小威如何利用MERFISH回答这个问题

　　

病原体入侵人体后，会产生发烧等症状，控制发烧症状产生的神经元细胞是哪些？激活这些控制发热症状神经元细胞的机制是什么？2022年6月份哈佛大学庄小威团队在Nature上发表了一篇题为A preoptic neuronal population controls fever and appetite during sickness的文章，借助MERFISH技术、免疫组化、荧光原位杂交、细胞消融反向验证等技术回答了这两个问题。揭示了病原体感染小鼠期间，血脑屏障通过旁分泌信号机制(神经元附近的非神经元细胞分泌免疫信号分子)来激活小鼠下丘脑腹侧内侧视前区神经元控制发热症状的产生。

免疫组织化学确定下丘脑视前区控制发热症状的具体位置—VMPO(腹侧内侧视前区)

向小鼠中注射LPS(革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分)模拟病原体感染生物体的现象，监控小鼠体温的变化，并在体温升高后检测被激活的神经元细胞（图1）。

图1.注射LPS后对小鼠进行体温检测并记录

小鼠体温升高后，通过富集到的大脑各区域中Fos阳性细胞的数量来判断大脑区域中被激活的位置，共有12个区域出现Fos阳性细胞的显著富集（图2-c），VMPO区域的细胞也被高度激活（图2-f）。VMPO区域与OVLT区域接近(OVLT为终板血管器，位于下丘脑视前区，该区域的功能与维持体温等稳态相关)。所以，作者推测LPS激活的VMPO区域中的细胞可能代表了长期以来所找寻的控制发热症状的神经元，作者们将该群细胞定义为VMPO^LPS神经元。

图2.c图为富集大脑各区域中Fos阳性细胞的统计表；d图为视前区各区域手绘核心区域图；e和f图为注射生理盐水和LPS后大脑各区域细胞被激活的情况；g图为外界温度升高时大脑各区域细胞被激活的情况。

MERFISH技术表征VMPO^LPS神经元细胞激活情况

确定VMPO位置与发热症状相关后，通过MERFISH超分辨率成像技术检测基因的表达，通过Gal/Amigo2两种特异性基因标志物表征VMPO神经元的分布，Adcyap1/Sncg两种特异性基因标志物表征AVPe （前腹侧脑室周围核）温度敏感性神经元的分布。结果揭示了LPS处理后，相比于AVPe神经元，VMPO^LPS神经元被强激活（图J）。

图3.鉴定LPS诱导后VMPO^LPS和AVPe两种神经元的激活情况（三张临近切片图）。蓝色和紫色圆点分别表示LPS处理后所有的VMPO^LPS神经元以及被激活的VMPO^LPS神经元在组织中的分布情况。黄色和橘黄色分别代表LPS处理后所有的AVPe神经元以及被激活的AVPe神经元在组织中的分布情况。红色圆点表示所有被激活的神经元在组织中的分布情况。可以通过查看紫色区域占蓝色区域的比例和橘色区域占黄色区域的比例来比较两种类型的细胞被激活的程度。

MERFISH技术表征神经元、血脑屏障和室周器官相关的多种神经元与非神经元细胞的空间分布与激活情况

为了进一步探索VMPO^LPS神经元被激活的机制，借助MERFISH技术对多种类型细胞的进行表征，可通过‘原汁原味’的图像结果（图4）观察到LPS诱导后小神经胶质细胞/抑制性神经元/激活性神经元等神经元细胞、组成血脑屏障的星形胶质细胞/内皮细胞/周细胞以及组成室周器官的室管膜细胞在组织中的分布以及激活情况。

图4.LPS诱导后，星形胶质细胞、内皮细胞、周细胞、室管膜、小神经胶质、抑制性神经元、激活性神经元等细胞在组织中的空间分布情况。绿色区域表示为该细胞类型在组织中的分布情况；红色区域表示所有被激活的细胞在组织中的分布情况；紫色的区域表示该细胞类型中被激活的细胞在组织中的分布情况；50um\250um\400um表示制作切片时距离前囟点（ Bregma ）最前端的距离。

MERFISH技术和ISH技术结合探究VMPO区域的神经元细胞被激活的机制—VMPO^LPS神经元细胞被局部的非神经元细胞分泌的免疫信号激活

以空间生物学的角度对两种非神经元细胞—室管膜和星形胶质细胞的空间分布进行进一步的分析，可直观的观察到被激活的室管膜和星形胶质细胞（紫色区域）分布在VMPO^LPS附近（图5）。通过ISH（荧光原位杂交）技术对Ptgs2（Prostaglandin E synthase 2 ，前列腺素氧化环化酶2）、il1β（interleukin-1β，白介素-1β）、ccl2（chemokine ligand 2，趋化因子配体2）三种免疫分子以及其受体进行表征，检测到三种免疫分子在VMPO区域附近确有表达，同时相应的受体蛋白也在VMPO^LPS神经元上有表达（图6），呼应了上述的VMPO^LPS神经元被局部的非神经元细胞分泌的免疫信号激活的预测。

图5.LPS激活后，室管膜和星形胶质细胞等非神经元细胞在组织中的分布情况。绿色区域表示所有该类型的细胞在组织中的分布情况；红色区域表示被激活的所有细胞在组织中的分布情况；紫色区域表示被激活的该细胞类型在组织上的分布情况。

 
图6.a-c:Ptgs2前列腺素氧化环化酶2、il1β白介素-1β、ccl2趋化因子配体2三种免疫分子在组织中的表达情况；d-i：三种免疫分子的相应受体的表达情况。ISH三通道分别为蓝色代表的DAPI通道；粉色代表的Fos蛋白通道；绿色代表的免疫分子和受体通道。

通过选择性消融VMPO神经元细胞从而确定其功能

为了验证VMPO^LPS神经元控制发热症状的功能，通过转染AAV-DTA（白喉毒素亚基A）系统来实现VMPO^LPS神经元消融的目的，荧光图（图e）表明该细胞消融成功。通过向阳性对照、阴性对照以及实验组三组小鼠（转染AAV-GFP系统、未转染AAV-DTA系统、转染AAV-DTA系统）分别注射生理盐水和LPS，观察到LPS诱导后，实验组小鼠未出现发热症状，进一步验证了VMPO^LPS神经元的功能。

图6.e图为选择性去除VMPO^LPS神经元的荧光检测图；f图为选择性去除VMPO^LPS神经元后再注射LPS，无法引起发热症状的产生。

此研究揭示了病原体感染期间，血脑屏障通过旁分泌信号机制来激活VMPO^LPS神经元控制发热症状的产生。MERFISH技术通过超分辨荧光原位成像的方式以单分子检测灵敏度检测基因的表达，定义不同的细胞类型，可保留空间位置信息，更直观的显示VMPO^LPS神经元细胞与室管膜、组成血脑屏障的细胞在组织中的分布具有空间位置邻近性，作为发现VMPO^LPS神经元细胞受到旁分泌细胞的激活强有力的证据，充分的展示了空间生物学的魅力。

参考文献：Osterhout JA, Kapoor V, Eichhorn SW, Vaughn E, Moore JD, Liu D, Lee D, DeNardo LA, Luo L, Zhuang X, Dulac C. A preoptic neuronal population controls fever and appetite during sickness. Nature. 2022 Jun;606(7916):937-944. doi: 10.1038/s41586-022-04793-z. Epub 2022 Jun 8. PMID: 35676482. DOI: 10.1038/s41586-022-04793-z

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