HiFi测序助力濒危物种保护

《诗经》有云“有鳣有鲔，以享以祀”。“鲔”即长江白鲟。白鲟从亿万年前恐龙的身边游进了中国人的《诗经》，见证了生生不息的中华民族和璀璨夺目的中华文化。遗憾的是长江白鲟没能游进21世纪的第二十三个年头，于北京时间2022年7月21日宣布灭绝！

全世界每天有75个物种灭绝，每小时有3个物种灭绝。万物各司其职的维护着食物链的复杂完整，失去任何一环都会影响生态系统的稳定。

长江白鲟的灭绝将“物种保护”这一话题拉回人们视野。在多种多样的物种保护措施中，基于HiFi技术（long High-Fidelity reads）的三代测序技术，通过构建濒危物种的基因组图谱，发掘其进化历程，了解其濒危原因，从而更好的为濒危物种的保护提供指导！

以HiFi测序为代表的三代测序技术，突破了二代测序GC偏好性及短读长对动物基因组组装的限制，HiFi reads（High Fidelity  reads）基于环化共有序列（Circular Consensus Sequencing，CCS）模式，产生出既有较长的读长（最长可达25kb的长度），又具有很高的序列精度（约99.9%准确率）的测序结果。这一技术对于基因组组装具有重要意义。不仅提高了组装效率、准确率，更重要的是能够实现gap free组装，构建真正意义上的完整基因组图谱。

举个栗子

来自西北农林科技大学动物科技学院的姜雨教授课题组发表了一篇名为Chromosome-level genome assembly for takin (Budorcas taxicolor) provides insights into its taxonomic status and genetic diversity 的文章。该文利用HiFi测序技术，构建了高灭绝风险的秦岭羚牛的第一个参考基因组，并在此基础上发现了秦岭羚牛的进化历程，同时揭示了其具有高灭绝风险的原因。

首先，研究人员面临的问题是，基于完整的线粒体基因组，发现羚牛与山羊关系更为密切，但这与之前依靠转录组分析发现羚牛与绵羊密切相关相悖，因此研究人员急需在整个基因组水平上进行进一步分析，以阐明羚牛的分类地位。研究人员利用HiFi测序以及Hi-C技术构建了秦岭羚牛的参考基因组，总共生成了 68.56 Gb 的 HiFi 读数（~23×）。使用 hifasm 软件组装了 4671 个重叠群。从头组装的参考基因组约为 2.95 Gb，contig N50 为 68.05Mb。如图1所示。通过构建系统发育树，发现在基因组水平上羚牛与麝牛的关系最为密切，大概从826万年前出现分化，如图2所示。

图1.秦岭羚牛基因组数据

图2.基于基因组组装的系统发育树

紧接着，研究人员利用基因组组装结果进行了染色体进化分析。以抹香鲸和长颈鹿作为外群，研究人员重建了牛、山羊、绵羊和羚牛的祖先核型。与牛科动物的祖先核型（2n = 60）相比，山羊的核型（2n = 60）只经历了一次易位，而绵羊的核型（2n = 54）则包括了3个融合和1个易位，羚牛的核型（2n=52）则包括了四次融合和一次易位。如图3所示，从牛到羊有 3 种染色体融合，包括 Chr 1 和 3 融合至 Chr 1，Chr 2 和 8 融合至 Chr 2，Chr 5 和 11 融合至 Chr 3。相比之下，从牛到羚牛有四个融合，包括 Chr 1 和22融合至 Chr 1，Chr 2 和 25融合至Chr 2，Chr 5 和 28 融合至 Chr 5，以及 Chr 11 和 23 融合至 Chr 11。易位发生从牛 Chr 9 到羚牛 Chr 14 和绵羊 Chr 9。

图3.羚牛、羊、牛的共线关系

最后，为了探究秦岭羚牛的濒危原因，研究人员进行了遗传多样性的研究。研究人员基于基因组测序结果，发现了3,328,260个SNP，远多于之前的研究。秦岭羚牛的SNP θπ为0.00028，同时9个秦岭羚牛基因组的平均杂合度约为0.00038，如图4a所示，该值远低于大熊猫金丝猴等保护动物。平均基因组近交系数（FROH）为0.217，如图4b所示。秦岭羚牛的遗传多样性极低，近交程度高，表明其处于严重的近交衰退和濒危状态。该文为更好的保护秦岭羚牛提供了宝贵资料。

图4.秦岭羚牛的遗传多样性分析

无独有偶，由于近亲繁殖造成种群濒危的还有太平洋袖珍鼠。今年7月21发表的文章A Chromosome-Length Reference Genome for the Endangered Pacific Pocket Mouse Reveals Recent Inbreeding in a Historically Large Population指明了保护濒临灭绝的太平洋袖珍鼠的方向。

研究人员首先利用HiFi测序，辅之以Omni-C和Hi-C技术，组装了太平洋袖珍鼠的基因组，如图5所示，基因组组装包括6,180 个scaffolds（N50 = 72.68 MB），其中28 个染色体长度的scaffolds。

在此基础之上，研究人员分析了平均基因组近交系数FROH为0.18，说明太平洋袖珍鼠内部存在严重的近亲繁殖。高质量的参考基因组为当前和未来的近交衰退、遗传负荷、结构变异以及该亚种的种群基因组数据研究提供了一个关键工具，并展示了高度连续组装对于管理和保护生物多样性的价值。

图5.太平洋袖珍鼠基因组测序结果

图6.平均杂合度分析

近些年，依靠HiFi测序技术先后组装了毛尾鼠袋鼠，雪豹，亚达伯拉象龟等濒危物种的基因组。在此基础之上，进行了种群结构历史分析，近交程度分析等，从而可以进一步了解其进化历程、濒危原因等，为保护这些可能消失的野生动物提供了宝贵的资料！

野生动物保护刻不容缓，保护遗传多样性，保护生态系统多样性，保护我们共同的家园！

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