RNA提取攻略之样本采集及稳定篇

本文介绍了获得高质量RNA需要注意的样本采集特别事项以及相关产品的选择指南，希望可以为您的研究或实验工作带来帮助。

1868年，瑞士生物学家弗雷德里希·米歇尔 (Friedrich Miescher) 在细胞核中发现核酸（当时还被称作“核素”），从此开启了RNA的探索之路。

迄今为止，在活细胞中总共发现了至少14种RNA，典型的单个快速生长哺乳动物细胞中含有10–30pg总RNA，而完全分化的原代细胞RNA含量则更少，仅约含1pg。其中，最为大家熟知的RNA有mRNA、rRNA、tRNA以及其他非编码RNA如lncRNA、snoRNA、miRNA、siRNA和piRNA等。

尽管不同类型中RNA的占比取决于细胞类型和生理状态，但占比最多的RNA分子还是tRNA和rRNA，mRNA仅占细胞总RNA 的约3–7％（图1）。

图1. 哺乳动物中RNA组成 ^[1]

无论是作为功能基因研究的mRNA还是具有调控功能的miRNA，对RNA的表达进行分析在很多情况下都是进一步进行其他研究的基础。目前常用的RNA分子生物学分析方法有qPCR、NGS测序等，无论采用哪种方法，结果的可靠性很大程度取决于所用RNA样品的质量。因此，RNA样本制备是下游分析实验成功的基础。

想要获得高质量的RNA，样本该如何采集？

无论是动植物样本还是其他样本，在处理和收集样本时，细胞中的RNA表达普通常会发生改变，即基因会在组织离体状态下会发生表达的上调或下调（图2）。另外，细胞内的RNA酶对RNA的降解也会在此期间发生，而同时启动的细胞凋亡程序也可能导致RNA转录水平的变化（图2）。

图2. 样本采集后mRNA水平变化。

因此，在收集用于RNA提取的样本，即在新鲜的组织在离开活体或者原本的生长环境时，通常需要立即并快速的将样本放入液氮中冷冻，或者后续长期在-80℃中保存。但样本中存在的内源性RNA酶在离开活体时即会开始降解RNA，且在后续样本破碎匀浆释放RNA的过程中同样也会发生内源性RNA酶对RNA的降解。所以，在样本采集时需要尽量使用RNA稳定保护剂，例如组织样本在采集后，可立即浸泡在适当体积的RNAprotect组织保护试剂中，从一开始就对样本进行保护。另外，在没有液氮时，如在野外进行样本采集时，同样可以使用相关RNA稳定保护剂，该操作只需在室温下操作便可以轻松、安全地稳定和保护样本中的RNA。

图3. 从经过稳定的样本中纯化得到未降解的RNA。获取大鼠肾脏后立即在RNAprotect Tissue Reagent中稳定或不进行稳定，0-60分钟后分阶段从稳定处理组和未稳定处理组的样本中纯化RNA并进行琼脂糖凝胶电泳和Northern blot分析。

QIAGEN RNA 稳定技术可实现：

▪ 即时稳定RNA
▪ 室温下操作，简便、快捷；无需使用液氮或干冰冷冻样品
▪ 运输和储存过程中，温度对细胞内RNA表达和RNA 完整性无影响
▪ 存储时间长，无RNA 降解

QIAGEN RNA 稳定技术在组织和细菌样本保存的表现

下图表示了从储存在RNAprotect Tissue Reagent中的组织样本中提取总RNA。[A]在指定条件下保存的大鼠肺组织，分别通过琼脂糖凝胶电泳和Northern blot（GAPDH探针)分析RNA。[B]小鼠肝组织进行反复冻融循环 (-20°C/25°C)。C为对照组织，立即冷冻于液氮并后续在-80°C保存。

从A和B的结果可以得出，储存在RNAprotect Tissue Reagent中的组织样本在不同的温度及反复冻融的条件下纯化得到的RNA具有较高的完整性。

图4. 组织中RNA稳定：不同的储存温度和反复冻融。

在下图的实验中，为了监测mRNA的降解，向生长的大肠杆菌培养物中添加RNA聚合酶抑制剂利福平来终止转录。随后将培养物等分成两半，并将RNAprotect Bacteria Reagent加入其中的一半培养物中。在进行离心和RNA纯化之前，样品在室温下分别放置0、4、8和16分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分析所得RNA（图5中上图）。通过Northern blot检测具有不同半衰期的两个标记基因的表达，分别得到中图ompA基因（半衰期为15分钟）和下图bla基因（半衰期为2-5分钟）的Northern blot结果。该实验结果表明，向细菌培养物中加入RNAprotect Bacteria Reagent能够有效的防止RNA降解，保持RNA的完整性且稳定时间可以持续长达16min。

图5. RNAprotect Bacteria Reagent 能够有效防止mRNA降解。

QIAGEN RNA稳定技术在动物全血样本保存的表现

研发人员分别使用RNAprotect Animal Blood Tubes和EDTA采血管收集来自同一只大鼠的血样 (500μl)，并将收集的样品在15–25℃下储存0分钟 (t=0) 至6小时，并随后使用RNeasy试剂盒纯化RNA后通过定量PCR来分析FOS表达量。Y轴上的ΔCT表示t=0样本时的CT值减去当下时间的CT值。该实验表明，在使用RNAprotect Animal Blood Tubes稳定的样品中，FOS基因表达保持稳定，但在EDTA管保存的样品中FOS的表达情况会随着时间延长而发生变化（在其他大鼠中观察到相同的结果；数据未显示）。

图6. 转录本得到有效稳定。

同样，在采用分光光度计法对从4只大鼠通过使用RNAprotect Animial Blood Tubes收集的血液样本中的RNA质量进行测定后可看到，不仅RNA产量稳定，且来自同一大鼠的不同血样RNA得率 (%CV) 的差异性仅在2.4%-5.9%之间。

图7. RNA高得率的可重复性。

除上述主要RNA样品采集和稳定产品外，QIAGEN还可提供针对多种样本类型及应用的相关产品，相关的性能参数我们也替您整理好了，如下所示：

以上便是获得高质量RNA需要注意的样本采集特别事项以及相关产品的选择指南，希望可以为您的研究或实验工作带来帮助。那么作为RNA提取实验的开端—“样本破碎”又有哪些注意事项？不同的样本分别适合的破碎方法有哪些？敬请关注“凯杰生命科学”，期待下期“RNA提取攻略之样本破碎篇”

参考文献：

1.Palazzo, A.F. and Lee, E.S. (2015) Non-coding RNA: what is functional and what is junk?  Front. Genet. 6:2

以上产品仅用于科研，相关实验数据除特殊标注外均来自QIAGEN内部测试结果。