基于激光显微切割技术的空间多组学研究方案

空间位置信息在转录组、基因组、蛋白组等组学研究中至关重要，目前也有一些方法可以在一次检测中同时进行转录组+蛋白组(panel)或者基因组+蛋白组(panel)的研究，但是仍然无法实现全转录组+全蛋白组或者全基因组+全蛋白组等的同时检测。基于激光显微切割技术从组织上精准获得单细胞或均质细胞以后，可以通过生物大分子提取，后续分别进行空间基因组、空间转录组、空间蛋白组以及空间代谢组等的多组学研究。

1 空间基因组研究方案

全基因组测序可在基因组水平上通过分析点突变、插入、缺失、拷贝数变异、结构变异等变异来预测罹患疾病的可能，或者用于临床诊断和指导治疗等。如对肿瘤样本的全基因组测序可以通过鉴定新的原癌基因或抑癌基因为肿瘤诊断、肿瘤临床结果预测和肿瘤靶标治疗提供新的基础。不同组织器官具有不同变异特点，即使同一组织不同空间位置的微量细胞群的变异也有各自特点，因此传统的基于大量细胞的基因组测序技术难以检测到组织中的这些突变。运用激光显微切割技术从高异质性的肿瘤等样本中获得微量均质细胞可以实现更加精准的位置特异性突变分析，为揭示突变的规律以及辅助精准医学检测和指导治疗提供必要的基础。

Hitomi Moriyama等2021发表在Anticancer Research上题为“Exome of Radiation-induced Rat Mammary Carcinoma Shows Copy-number Losses and Mutations in Human-relevant Cancer Genes”的文中，使用MMI CellCut激光显微切割系统切割捕获均质的大鼠乳腺肿瘤上皮细胞，结合全外显子测序，发现中子暴露可能是通过类似于人类乳腺癌中发现的基因突变和拷贝数丢失，增加管腔乳腺癌的发病率。实验具体流程如下：

全外显子组测序结果显示中子和γ 射线辐照导致大鼠乳腺癌局部拷贝数丢。

中子和γ射线辐照大鼠乳腺癌突变谱以C:G>T:A 跃迁为主。

2 空间转录组研究方案

单细胞转录组分析可以重建胚胎细胞的发育轨迹，但缺乏真实的空间信息，无法将发育调控过程中的时间和空间信息整合分析，而细胞在早期胚胎中的空间位置对其发育分化命运至关重要。景乃禾、彭广敦及其合作团队建立了一种基于MMI激光显微切割技术的低起始量空间转录组分析方法，绘制出小鼠早期胚胎发育全胚层谱系发生时空转录组图谱，将极大推动早期胚胎发育和干细胞再生医学相关领域的发展。除此以外，肿瘤、神经等组织同样具有相当高的异质性，若以整块组织(Bulk tissue)为样本进行基因表达等研究，并不能真实反映该组织中异质细胞真实的基因表达。因此，以同质细胞作为实验样本成为转录组学研究的必需，激光显微切割技术就成为获得特定空间位置同质细胞的不可或缺的工具。

使用显微切割技术可以揭秘胚胎细胞发育调控过程中的时间和空间信息。景乃禾、彭广敦及其合作团队19年在Nature上发表题为“Molecular architecture of lineage allocation and tissue organization in early mouse embryo”和17年在Nature Protocols上发表题为“Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq”的两篇文章中，建立了一种基于MMI激光显微切割技术的低起始量空间转录组分析方法，绘制出小鼠早期胚胎发育全胚层谱系发生时空转录组图谱，极大推动早期胚胎发育和干细胞再生医学相关领域的发展。

下图为激光显微切割捕获特定部位胚胎细胞

切割捕获后的5-20个细胞进行RT-qPCR,24个样本GAPDH RT-PCR结果Ct值16-18；使用安捷伦2100质控cDNA文库质量，无引物二聚体和短片段，说明RNA浓度高、完整性好。

前端外胚层特异性表达基因，玉米热图与原位杂交结果高度一致。

E2.5时期到E7.5时期的空间结构域相似性。构建了小鼠早期胚胎所有表达基因高分辨率的数字化原位图谱，建立起强大的全基因组时空表达数据库，是目前国际上关于小鼠原肠运动时期更全面、更完整的交互性时空转录组数据库。

激光显微切割技术在植物组织上同样适用，2018年Ronny Brandt等人在Methods in Molecular Biology上发表题为“Laser Capture Microdissection-Based RNA-Seq of Barley Grain Tissues”的文章中，激光显微切割技术切割获得胚乳转移细胞后，转录组测序鉴定与细胞特异性以及在大麦发育过程中胚乳细胞化有关的不同基因组。

3 空间蛋白组研究方案

通过RNA-Seq、表达谱芯片等技术可以在转录水平上研究基因的表达，以发现疾病相关的重要生物标志物。根据中心法则，基因表达的最终形式是蛋白，生物性状归根结底是通过蛋白表达及修饰得以呈现。因此，蛋白组学研究越来越受到生命科学研究者的重视。以往多数蛋白组学分析是 bulk 数据，缺乏细胞的空间位置信息。通过激光显微切割技术可以在可视化状态下有目的性的选择特定位置的细胞或组织区域，保留了其空间位置信息，后续通过聚焦式超声技术匀浆微量的组织或细胞，可保证蛋白质充分释放并维持其完整性，有利于增加蛋白质谱鉴定出的蛋白质复杂度，提高蛋白组学研究效率。以下是我们提供的实验方案：

2020年Jeremy A. Herrera等人在Clin Proteomics上发表题为“Laser capture microdissection coupled mass spectrometry (LCM-MS) for spatially resolved analysis of formalin-fixed and stained human lung tissues”的文章。使用CellCut Plus激光显微切割系统对5μm H&E染色人肺FFPE切片进行切割，结合聚焦式超声和LC-MS用于低起始量样本的蛋白组学分析。

激光显微切割捕获肺血管和相邻的肺泡

经LE220-Plus聚焦式超声系统超声处理 + 热处理 + 5% SDS处理的样本蛋白提取得率比热处理 + 5% SDS处理以及5% SDS处理的样本均要高。

特发性肺纤维化样本中由形态正常的肺泡和血管组成的胞外基质。a图b图显示经质谱鉴定分析出的分别在形态正常的人肺泡和血管中总蛋白数量以及胞外基质蛋白数量。c图显示在肺泡和血管中特异性表达的基因。d图显示序列切片经H&E染色、anti-LamB1和 anti-TNC 染色结果。比例尺代表100 μm。

本文开发了可以使用低至0.0125 mm³的组织样本用于质谱分析的方法学，更重要的是能保留空间位置信息。这种新颖的微蛋白质组学方案有望针对各种病理学的复杂组织进行组学图谱的研究。

肿瘤样本中临床相关蛋白的表达水平可以用来指导癌症疗法的选择，目前临床中应用最广泛的是基于抗体的免疫组化方法。现在基于质谱 (MS) 的定量蛋白质组学也越来越多地应用于临床样本，以便客观地定量跟治疗相关的蛋白生物标志物的肿瘤表达水平。

2018年Yeoun Jin Kim等发表在J Proteome Res上题为“Data-independent acquisition mass spectrometry to quantify protein levels in FFPE tumor biopsies for molecular diagnostics”的文章中，使用CellCut Plus激光显微切割系统对12位肠胃癌患者活检组织FFPE样本进行切割，处理样本后使用DIA质谱方法定量肿瘤活检FFPE样本蛋白水平用于分子诊断。

12 份活检表达了精选数据库癌症基因组解释器 (CGI) 中列出的 201 个非冗余癌症生物标志物中的 40 个。此外，在检测到的蛋白质中，有 131 个是 FDA 批准的治疗目标。

DIA-MS与激光显微切割技术相结合，保证了样本均质性，实现了良好的覆盖深度(蛋白拷贝数5个数量级)。基于 DIA-MS 的临床 FFPE 肿瘤活检分析代表了一种有吸引力的诊断方法，将可靠的定量与广泛的蛋白质组覆盖范围相结合。

更多空间组学应用方案

切割捕获均质前列腺肿瘤细胞

切割捕获恒河猴舌头味蕾细胞

切割捕获小鼠内侧神经嵴细胞

切割捕获小鼠脑冰冻切片海马CA2区细胞

参考文献：

1、HITOMI MORIYAMA. et al. Exome of Radiation-induced Rat Mammary Carcinoma Shows Copy-number Losses and mutations in human-relevant cancer genes. ANTICANCER RESEARCH (2021)41: 55-70
2、Guangdun Peng.et al. Molecular architecture of lineage allocation and tissue organization in early mouse embryo.Nature.(2019)572,528-532
3、Guangdun Peng.et al. Molecular architecture of lineage allocation and tissue organization in early mouse embryo.Nature. 572,528-532(2019)
4、Ronny et al., Laser Capture Microdissection-Based RNA-Seq of Barley Grain Tissues. Methods in Molecular Biology, vol. 1723.2018
5.Herrera et al. Laser capture microdissection coupled mass spectrometry (LCM-MS) for spatially resolved analysis of formalin-fixed and stained human lung tissues. Clin Proteom (2020, 17:24)
6.Yeoum, et al. Data-independent acquisition mass spectrometry to quantify protein levels in FFPE tumor biopsies for molecular diagnostics. J Proteome Res. 2019.18(1): 426–435
 
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