《Nature》“Live-Seq”技术让活细胞测序成为可能

Live-seq可以在不杀死或显著改变单个细胞的情况下对转录组进行测序。Live-seq结合了优化的流体力显微镜方法(原子力显微镜利用微小通道从细胞中提取包括mRNA在内的细胞质，而不需要裂解)和高度敏感的单细胞转录组学方法(从提取的细胞质样本中存在的微量mRNA获得全基因组基因表达谱)。

　　

EPFL的科学家Bart Deplancke博士是这项研究的资深作者。

到目前为止，所有的全基因组测序技术都通过杀死细胞来窥视其秘密。这种技术上的限制排除了细胞测序后对细胞生物学特性或分子特征进行后续分析的可能性。

由EPFL的Bart Deplancke博士和苏黎世联邦理工学院的Julia Vorholt博士领导的研究小组改进了单细胞RNA测序技术，该方法现在可以从单个细胞中获得数千份转录本的序列，从而在不破坏细胞的情况下推断出基因活动。

这项名为Live-Seq的新技术的发展细节发表在《自然》(Nature)杂志上的一篇文章中，这项创新使得在微创条件下收集和分析活细胞的RNA成为可能。

“它[Live-seq]是一种优化的流体力显微镜方法的结合——本质上是一种带有中空悬臂的原子力显微镜，它允许我们从细胞中提取细胞质(因此也包括mRNA)，而不需要裂解它，它内部开发的高度敏感的单细胞转录组方法，允许我们从细胞质提取物中存在的微量mRNA中提取全基因组基因表达谱，”Deplancke说。

流体显微镜(FluidFM)使用注射器等微小通道在显微镜下移动微小体积的液体。这使得研究人员能够在不破坏细胞的情况下从活细胞中注射和提取RNA等分子。FluidFM是由苏黎世联邦理工学院发明的，并在早些时候的研究中进行了报道，已经成为对单个细胞进行实验的通用工具。

苏黎世联邦理工学院生物系教授，这项研究的资深作者Julia Vorholt博士。

Vorholt说:“FluidFM结合了原子力显微镜的高精度和体积控制的分配，可以达到1L的万亿分之一（picoliter），甚至在光学控制下。它可以作为一种纳米大小的注射器用于各种应用，作为一种微创工具，例如，向细胞内注射液体或小物体，或从细胞内提取它们以保持它们的生命。”

除了FluidFM，保存微小细胞质样本和这些样本的RNA序列的能力导致了Live-seq的开发。这项技术促进了时间转录组分析，在细胞寿命延长的过程中，数千个基因的基因活动可以在谨慎的时间点上进行监测，从而引发了之前无法解决的科学问题。

“有了Live-seq，我们现在可以独特地解决高度有趣和生物医学相关的问题，例如，为什么某些细胞分化或对抗癌药物有耐药性，而它们的姐妹细胞却没有，”Deplancke说。

Live-seq是否适用的一个关键问题是该技术能否在不破坏细胞生物学特性的情况下对转录组进行测序。为了解决这一问题，研究人员证明了Live-seq可以在不显著改变细胞功能反应或生长的情况下区分各种细胞类型。他们表明，通过序列分析巨噬细胞感染前后的转录组，以及脂肪干细胞分化为脂肪细胞前后的转录组，Live-seq可以直接绘制细胞的时间轨迹。

“从转录组和表型上取样的细胞似乎很难与未探测的细胞区分开来。这对我们来说是一个令人惊讶的结果，因为它表明细胞质取样的影响最多是轻微的，”Deplancke说。

Live-seq可以帮助解决生物学中的一些谜题，这些谜题由于缺乏用于时间研究的仪器而无法通过实验更早地解决。

“我们不会杀死细胞。这使我们能够监测该细胞的情况，比如它是否会分化成一种特定的细胞类型，它是否会对特定的免疫刺激做出反应，或者它是否会对抗肿瘤药物产生耐药性或易感。我们可以沿着这些轨迹对细胞进行多次采样，而不会对细胞产生重大影响或杀死细胞。在每个时间点，我们都可以识别与细胞表型变化相关的基因，这使我们能够找到细胞行为的分子决定因素，这是生物学中一个伟大的突出问题。”

Deplancke和他的团队打算使用Live-seq来记录单个细胞在关键生物过程中的分子变化，就像单个图像可以串成一个讲述故事的电影一样。

Live-seq enables temporal transcriptomic recording of single cells