Nature子刊：新型便携式诊断仪同时检测SARS-CoV-2 RNA和抗体

你患过COVID吗?它是什么品种的?你现在免疫了吗?现在，有一种方法可以在几个小时内得到所有这些问题的答案，而不需要把样本送到实验室。Wyss研究所的成员创造了一种新的即时护理诊断设备，将我们的eRapid和SHERLOCK技术结合成一个明信片大小的单一系统，可以同时检测患者唾液中是否存在SARS-CoV-2 RNA和对抗该病毒的抗体。该系统可以很容易地定制，以对抗未来的大流行病原体。

　　

随着COVID-19大流行的发展，我们一直在问自己的问题已经从“我如何知道我是否被感染了?”到“我的免疫力有多强?”到“我是哪一种病毒?”而且，随着新的变种不断出现，我们很可能会一直问自己这些问题，通常是在同一时间。

现在，有一种方法可以在几个小时内得到所有问题的答案，而不需要把样本送到实验室。哈佛大学Wyss生物灵感工程研究所的成员创造了一种新的即时护理诊断设备，将该研究所的eRapid和SHERLOCK技术集成到一个明信片大小的单一系统中，可以同时检测患者唾液中是否存在SARS-CoV-2 RNA和对抗该病毒的抗体，以及可能存在的其他多种生物标志物。

麻省理工学院媒体实验室和Wyss研究所的研究生Devora Najjar是第一作者之一，他说:“这种诊断方法可以在一段时间内对人群中的感染和免疫进行更便宜的多路监测，其准确性与昂贵的实验室测试相当。这种方法可以极大地改善全球对未来大流行的应对，也可以深入了解个人应该接受哪种治疗。”《Nature Biomedical Engineering》上发表的一篇新文章描述了这种原型设备。

新病毒的新化学成分

这一诊断是由威斯学院核心教员Jim Collins博士和Don Ingber(他也是该研究所的创始主任)实验室的合作产生的。由Ingber和Wyss高级研究员Pawan Jolly博士领导的eRapid团队，以及由Collins和Helena de Puig博士(Wyss博士后)领导的SHERLOCK团队认识到，虽然基于SHERLOCK的诊断可以以极高的灵敏度检测分子，但它们本质上受到基于荧光的读取系统的限制。如果他们能找到一种方法，将SHERLOCK这样基于CRISPR的系统的分子检测转化为像eRapid产生的电化学信号，他们就能创造出一种具有实验室级别精度的诊断，可以在非实验室环境下使用。他们开始制造这种混合设备并选择莱姆病作为他们的目标应用。几个月之内，他们就把它修好了。随后，COVID-19大流行袭来。

“在早期，每个人都在致力于开发能够检测SARS-CoV-2病毒或抗体的诊断方法，但不能同时检测两种病毒。由于我们在莱姆病方面的工作，我们知道我们可以成功地通过电化学方法检测到DNA和RNA分子的存在。我们决定找出如何将其与抗体检测结合起来，以创建一种一体化测试，帮助跟踪感染和抗击大流行，”该论文的第一作者之一de Puig说。

但是，创建一个能够整合病毒RNA和人类蛋白质检测的平台是一个挑战。研究小组必须弄清楚如何同时进行两种不同类型的分子反应，然后将它们整合到一个报告系统中，以便同时读取结果。

他们选择唾液作为样本材料，因为在那里都能找到病毒颗粒和抗体。对于诊断的SHERLOCK部分，即检测SARS-CoV-2 RNA的存在，该设备需要能够从唾液样本中提取、浓缩和放大病毒RNA，然后将其与CRISPR试剂混合，并将得到的溶液输送到eRapid芯片部分进行检测。

该团队设计了一个由多个储层、通道和加热元件组成的微流体系统，可以在原型设备内自动混合和传输物质，而不需要用户输入。在第一个腔室中，唾液与一种酶结合，这种酶可以打开任何病毒的外膜，暴露它们的RNA。然后将样品泵入反应室，加热并与环介导等温扩增(LAMP)试剂混合，以扩增病毒RNA。放大30分钟后，将含有SHERLOCK试剂的混合物加入实验室内，然后将样品泵入eRapid电极上。

在混合物中没有SARS-CoV-2遗传物质的情况下，带有生物素的单链(ssDNA)分子与电极表面的肽核酸(PNA)分子结合。然后，生物素与混合物中的另一种分子聚合酶链霉亲和素结合，从而导致第三种分子，四甲基联苯胺(TMB)以固体形式从液体溶液中析出。当固体TMB落在电极上时，它的导电性就会改变。这种变化被检测为通过电极的电流量的差异，表明样品没有病毒。

然而，如果唾液样本中存在任何SARS-CoV-2遗传物质，SHERLOCK混合物中的CRISPR酶就会切断它和ssDNA。这种切割作用将生物素分子从ssDNA中分离出来，因此当ssDNA与PNA结合时，它不会触发导致TMB沉淀到电极上的一系列反应。因此，电极的电导率不变，表明测试结果为阳性。

“基于PNA的分析与我们为该设备创建的多酶标链霉亲和素/TMB反应化学相结合，使我们能够检测SARS-CoV-2的存在，灵敏度比我们最初的基于荧光的SHERLOCK技术高4倍，并在大约相同的时间内产生结果，”共同第一作者Joshua Rainbow博士说，他曾是威斯研究所的访问研究生，现在是巴斯大学的博士生。“它还能够100%准确地检测到病毒RNA的存在。”

大于各部分之和

与此同时，该团队定制了其余3个eRapid电极，将患者可以产生抗体的不同COVID相关抗原镶嵌在电极上:刺突蛋白(S1)的S1亚基、该亚基内的核糖体结合域(S1-RBD)和N蛋白，N蛋白存在于大多数冠状病毒(N)中。如果患者的唾液样本包含一种或多种这种抗体，它们就会与电极上的伴侣抗原结合。附着在生物素上的第二抗体将与目标抗体结合，触发相同的poly-HRP-streptavidin/TMB反应，并引起电极电导率的变化。

研究人员使用以前SARS-CoV-2检测呈阳性的患者的人体血浆样本测试了这些抗体特异性传感器。该系统能够区分针对S1、S1-RBD和N蛋白的抗体，准确率超过95%。

“能够轻松地区分不同类型的抗体对于确定患者的免疫是由于疫苗还是感染，并随着时间的推移跟踪这些不同的免疫水平的强度是非常有益的，”Sanjay Sharma Timilsina博士说，他是Wyss研究所的前博士后研究员，现在是StataDX的首席科学家。“将其与病毒RNA检测结合在一个便携式多路诊断平台上，可以全面了解患者在感染期间和之后的健康状况，这对实施公共政策和疫苗接种战略至关重要。”StataDX正在将eRapid商业化，用于神经、心血管和肾脏应用。

最后，研究小组利用SARS-CoV-2患者的唾液测试了结合的病毒RNA和抗体电极。他们将唾液分成两部分，一部分加入抗体库，另一部分加入设备的RNA库。两小时后，他们测量了电极的读数，看看是否正确地记录了抗体和RNA的存在。研究小组发现，多路芯片正确识别阳性和阴性RNA和抗体样本，准确率为100%。它还非常敏感，能够检测到每微升0.8拷贝的RNA。

“目前，还缺乏低成本的诊断平台，可以在不需要前往实验室的情况下准确检测多种分子。我们的系统提供了最好的两个世界-高精度和低成本的多路平台-可以为患者和临床医生提供大量的价值在护理点。此外，它很容易适应广泛的应用。这种诊断设备让我兴奋的地方在于，它结合了高水平的准确性和灵活的设计，这可能使它成为我们应对未来流行病的主要工具。”

该原型设备的低成本和紧凑的设计是用户友好的，最大限度地减少了患者需要执行的步骤，减少了操作错误的可能性。定制的墨盒可以很容易地制造出来，用于检测不同疾病的抗原和抗体，不限使用场景。

Lab-on-a-chip multiplexed electrochemical sensor enables simultaneous detection of SARS-CoV-2 RNA and host antibodies