用于选择性背景噪声抑制的频域STED显微镜

受激发射耗尽(STED)显微技术是由Stefan W. Hell和Jan Wichmann于1994年开发的，并于1999年由Hell和Thomas Klar实验证明，是一种用于纳米显微镜的超分辨率技术。STED显微镜技术已经取得了长足的进步，并被广泛应用于实际研究中。但在实际应用中会涉及到一些不良的背景噪声，从而对空间分辨率和图像质量产生负面影响。据《先进光子学》报道，浙江大学的研究人员最近开发了一种新的方法，称为“双调制差”(dmdSTED)，可以有选择地有效抑制背景。该方法的工作原理是将空间域信号分选到频率域，从而方便地将非耗尽的荧光和sted诱导的背景从所需的荧光信号中分离出来。

　　

   

   

图像:在生物成像中，频域STED显微镜选择性抑制背景。    

纳米技术描述的是在200-300纳米的光学极限之外的观察能力。受激发射耗尽(STED)显微技术是由Stefan W. Hell和Jan Wichmann于1994年开发的，并于1999年由Hell和Thomas Klar实验证明，是一种用于纳米显微镜的超分辨率技术。STED显微镜技术已经取得了长足的进步，并被广泛应用于实际研究中。但在实际应用中会涉及到一些不良的背景噪声，从而对空间分辨率和图像质量产生负面影响。一般来说，这种噪声来自两个信号源:(i)耗尽束的超高光剂量引起的再激发产生的荧光;(ii)残留荧光，由于抑制束的耗尽不足。

重要的背景去除方法在过去的几十年已经开发出来。它们可以分为三类:时域、空域和相量域。这些方法中有些由来已久，有些是最近才发展起来的。虽然有强大的方法可以从STED显微镜图像中去除不良噪声，但它们都有缺点，包括图像失真、长时间采集或引入镜头噪声。STED显微镜技术还没有实现它的全部潜力。

据《先进光子学》报道，浙江大学的研究人员最近开发了一种新的方法，称为“双调制差”(dmdSTED)，可以有选择地有效抑制背景。该方法的工作原理是将空间域信号分选到频率域，从而方便地将非耗尽的荧光和sted诱导的背景从所需的荧光信号中分离出来。激励光束和耗尽光束分别加载不同的时域调制。由于避免了耗尽束引起的再激发，因此可以选择波长更接近样品荧光发射光谱峰值的耗尽激光器，从而降低了所需的耗尽强度。

当前版本的dmdSTED方法的空间分辨率为λ/8，比容易产生散点噪声的相角域方法(如SPLIT、λ/5)的分辨率更高。理论上，这种方法可以避免时域方法(如时间门控)造成的潜在信号损失。此外，dmdSTED兼容脉冲或连续波场景，并且不需要时间相关单光子计数(TCSPC)硬件。与空间域方法相比，dmdSTED方法的时间分辨率不受限制。因此，dmdSTED在空间分辨率、信噪比和时间分辨率等方面都具有较好的综合精细显微图像获取优势。

据资深作者、现代光学仪器国家重点实验室主任刘旭介绍，“这种频域方法具有很大的潜力，可以集成到其他双光束点扫描技术中，如激发态饱和显微镜(ESSat)、电荷态耗尽显微镜(CSD)、基态耗尽显微镜(GSD)等。”“此外，它可以接受更多类型的样品，这些样品的光谱特征不同于普通的荧光染料，例如一些激发光谱更宽的量子点。”