哈医大肿瘤医院庞达团队在乳腺癌液体活检领域取得新进展

　　

据世界卫生组织统计，2020年全球有230万名女性被诊断患有乳腺癌，有68.5万人死亡。鉴于新发病例数的快速增长，乳腺癌已取代肺癌成为全球第一大癌症。在我国，乳腺癌的发病率也呈逐年上升趋势，每年有30多万名女性被诊断出乳腺癌。

不过，乳腺癌的死亡率却呈下降趋势，这要归功于早发现和早治疗。乳腺癌的早发现可以带来更好的预后。乳腺钼靶检查是最常用的乳腺癌筛查手段之一，但亚洲女性的乳腺腺体致密，严重限制了其发现乳腺癌的灵敏度。据统计，钼靶检查的灵敏度在68%-93%，具体取决于医生经验、患者年龄和乳腺密度等因素。

循环游离DNA（cfDNA）的甲基化检测有望弥补乳腺钼靶检查的不足。近日，哈尔滨医科大学附属肿瘤医院庞达教授团队联合基准医疗范建兵博士团队开发出了一种cfDNA甲基化模型用于乳腺癌诊断，其性能优于乳腺钼靶检查。这项成果发表在《npj Breast Cancer》杂志上。

乳腺癌特异性的DNA甲基化发生在肿瘤形成的早期。多项研究分析了甲基化状态以及利用cfDNA来检测癌症的效果。为了实现全基因组甲基化分析，该研究团队还开发出一种高度灵敏的DNA甲基化测序技术，用来分析cfDNA的甲基化状态，并将其命名为AnchorIRIS™分析。

建立乳腺癌诊断的甲基化预测模型

图1. 研究设计的流程图

在这项研究中，研究人员首先分析了癌症基因组图谱（TCGA）数据库中40对配对的乳腺癌及癌旁正常组织的甲基化数据，筛选出一个包含3288个标志物的乳腺癌特异性甲基化panel。通过过滤背景甲基化模式(noise methylation patterns），他们筛选出1996个标志物用于进一步分析（图1）。在此过程中，靶向富集CpG位点的探针是由Twist Bioscience合成的。

同时，研究招募了204例女性乳腺癌患者（平均年龄为51岁），其中108例被分到训练集、47例分到验证集，还有49例被分到独立测试集。他们还招募了129例健康志愿者（平均年龄为49岁）。他们采集乳腺癌组织和血浆样本，并开展靶向亚硫酸氢盐测序，开发出一个含有26个标志物的诊断预测模型，其区分恶性疾病和正常病变的灵敏度为89.37%，特异性为100%。

在进一步简化模型后，他们发现含有4个标志物的模型（cg23035715、cg16304215、cg20072171和cg21501525）也具有相似的诊断能力。值得注意的是，cg23035715具有最好的诊断能力（AUROC=0.9395，AUPRC= 0.9111）。这个目标区域在乳腺癌患者中是低甲基化的，而其他三个位点都是高甲基化的。

研究人员随后在独立测试集上测试了候选的DNA甲基化标志物，这个测试集共包括49个恶性和55个正常供体的血浆样本。他们发现，26个标志物的诊断预测模型区分乳腺癌患者和正常对照的灵敏度为87.76%，特异性为92.73%（AUROC=0.9449，AUPRC= 0.8640）。这些结果表明，cfDNA甲基化分析可能有助于乳腺癌的诊断。

甲基化预测模型的诊断能力优于钼靶检查

之后，研究人员比较了cfDNA甲基化和乳腺钼靶检查的诊断能力。这种26个标志物的甲基化预测模型对乳腺癌的诊断能力（AUROC=0.9815，AUPRC=0.9800）优于钼靶检查（AUROC=0.9315，AUPRC=0.9490）（图2）。此外，该模型区分恶性疾病和正常病变的灵敏度为94.79%，特异性为98.70%。由此可见，cfDNA甲基化预测模型在诊断能力上优于钼靶检查。

图2. 甲基化标志物与钼靶检查的诊断能力比较

总的来说，研究人员开发出了一种基于cfDNA甲基化模式的诊断模型，可作为早期诊断乳腺癌的可靠方法。他们认为，简化后的四标志物模型在乳腺癌早期诊断和筛查方面具有巨大的临床潜力。

编者按：

去年，基准医疗曾与Twist Bioscience合作推出了一款Twist-基准甲基化泛癌检测产品，适用于甲基化文库制备和靶向富集。该产品涵盖47个TCGA（癌症基因组图谱）疾病类型，包括肺癌，乳腺癌，结直肠癌等31种癌症，可用于研究多种癌症的发生、发展和转移等肿瘤生物学相关的基因调控过程（甲基化水平）。

此外，基准医疗与Twist Bioscience联合申报的“基于液体活检的泛癌种cfDNA甲基化高通量测序及人工智能辅助诊断系统的开发与应用”项目近日获得广州市黄埔区科学技术局国际科技合作项目立项，最高可获200万区财政经费支持。

Twist NGS 甲基化检测系统采用了 New England Biolabs®的革新性酶学转化法甲基化测序（EM-seq™）。它将亚硫酸氢盐测序替换为一系列酶转化步骤，最终将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶。这种EM-seq方案能够减少对DNA的损伤，甲基化检测率较传统的亚硫酸氢盐流程提高多达15%。

转化后，靶向富集可提高方法的灵敏度。Twist 针对甲基化检测进行优化，开发了定制甲基化组合。这些组合中包含的探针可捕获给定位点可能存在的全部四种序列（甲基化、未甲基化、正义和反义）。而且，这些甲基化组合与所有 Twist 定制组合一样，具有高保真性、均一性和灵活性，能够稳定、灵敏地进行甲基化测序。

Twist NGS 甲基化检测系统将 EM-seq 方案与定制甲基化组合相结合，减少了样本损失，并对关键靶标进行富集，是一款检测cfDNA样本中甲基化模式的高度灵敏的工具。

原文检索

Zhang, X., Zhao, D., Yin, Y. et al. Circulating cell-free DNA-based methylation patterns for breast cancer diagnosis. npj Breast Cancer 7, 106 (2021). https://doi.org/10.1038/s41523-021-00316-7