简介 类风湿性关节炎（RA）是一种自身免疫性疾病，其特点是关节破坏、全身受累、存在自身抗体，尤其是抗瓜氨酸肽抗体（ACPAs）。 临床上，ACPAs的存在表明软骨和骨严重损伤的可能性增加，以及严重关节变形的预后差( 1)对疾病病理生理学的深入研究表明，不同的炎症途径可导致类风湿关节炎的异常全身免疫反应。 有人提出，免疫反应失调的起源发生在有遗传倾向的个体中，环境对免疫反应的影响很大。 在环境因素中，肠道微生物群已成为类风湿关节炎（RA）异常全身免疫反应的一个可能候选因子( 2– 4).
肠道微生物群在维持免疫稳态和扰乱肠道菌群组成的平衡中至关重要，肠道微生物群可以改变局部适应性免疫反应并调节全身炎症。 此外，肠道微生物群衍生的代谢物，特别是短链脂肪酸（SCFAs），可以通过调节T细胞的葡萄糖代谢来诱导T细胞的代谢改变。 最近的多项证据表明肠道失调与RA的发病机制有关。 一项开创性的研究报告称 普雷沃菌属 丰度与 拟杆菌 新发未经治疗的类风湿关节炎（NORA）患者中有益微生物的流失( 2)随后的研究表明，类风湿关节炎患者的肠道失调与革兰氏阴性菌的减少和革兰氏阳性菌的富集有关( 三, 4).
虽然口腔和粪便失调已经在类风湿关节炎中被描述过，但是由于个体间的高度多样性，研究障碍仍然存在，这受到遗传、年龄、饮食和健康状况等广泛因素的影响( 5)疾病的多样性和与疾病相关的生物群的多样性往往难以控制。 因此，宏基因组研究的结果高度依赖于采集的样本，并且常常包括随机的假阳性或阴性( 6, 7).
遗传学的研究长期以来一直利用遗传学的机会来确定双胞胎的特征( 8)这一概念已被扩展到“配对”动物研究的宏基因组学研究中，其中配对样本来自不同表型的同居动物或纵向取样( 6, 9)在这个概念的基础上，我们先前描述了一种新的宏基因组分析策略，即“准配对队列”，在这个策略中，我们将显示相似物种特征但不同表型的样本配对( 10)简单地说，这种方法首先从一个包含物种丰度的矩阵开始，该矩阵是从显示二元表型的样本的基于测序的宏基因组数据推断出来的（例如，患病对照组与健康对照组）。 这个矩阵被用来填充一个高维空间，每个检测到的物种作为一个维度。 假设两个样本具有相似的物种轮廓，但具有相反的表型，理论上应位于欧几里德空间中描述两个表型状态的边界附近( 11)我们引入了“边界样本”的概念，即最近邻具有相反表型的样本，并将每个边界样本与其对侧的一个最近邻配对，形成“孪生子” 为了避免偏差，我们为两侧选择多个平行边界样本，然后比较孪生样本中每种物种的丰度或存在/缺失情况，以确定两种表型中每一种的候选物种（详见材料和方法）。 这种方法使我们可以将原始的群体队列转换为成对队列，这样不仅可以控制个体的多样性，而且可以增加统计能力( 10).
在本研究中，我们采用准配对队列策略，报告了类风湿关节炎患者中丁酸盐产生种类的缺乏和丁酸盐消费者的富集，这与ACPA的产生和关节畸形有关。 我们进一步证明，饮食中添加丁酸盐有助于平衡卵泡辅助剂T（T FH公司 )细胞和调节性T细胞（T 雷格斯 )我们的发现揭示了丁酸代谢物种在类风湿关节炎发病机制中的关键作用，并提示了丁酸盐在类风湿关节炎中的治疗潜力。
结果 丁酸代谢产物组成与类风湿关节炎有关 在比较25名接受治疗的单纯类风湿性关节炎患者与29名年龄和性别匹配的健康人（表S1和 图1)，两组的微生物多样性没有显著差异（图S1）。 两组之间所有细菌种类的单方差比较没有发现任何明显的偏差物种[Mann Whitney 美国 检验，错误发现率（FDR）<0.05]，这并不奇怪，因为在元基因组数据中个体间存在着巨大的差异。 处理这些高维数据集是非常困难的，因为许多辅助因子很难控制( 12, 13)。控制多样性的一种常见方法是进行荟萃分析，通常包括大量样本。
图1 本研究参与者的流动。
类风湿关节炎患者和健康人的登记和分析图表。 我们招募了两组接受或不接受治疗的类风湿关节炎患者，并对每个受试者的肠道基因组进行了鸟枪式测序。 队列I是治疗初发RA（NORA）和健康个体。 第二组为类风湿关节炎患者和健康人。
在这项研究中，我们使用了一种新的准配对队列策略( 10)基于一个由25名未接受治疗的患者和29名配对对照组成的小队列研究。 这一策略的灵感来自配对研究的概念( 6, 9)简单地说，我们重建了一个准成对队列，其中具有相似物种特征但表型相反的样本是孪生的，然后通过配对样本的统计检验来识别具有RA相关特征的物种。 因此，共发现186个类群相关种，其中149个类群比例过高，37个类群不足（表S2；成对样本的Wilcoxon符号秩检验， P <0.0001）。 出乎意料的是，根据之前的数据，186个物种中有55个（29.6%）能够代谢丁酸盐（表S3）( 14, 15)值得注意的是，55名RA相关丁酸代谢产物中有51名（92.7%）是丁酸盐消费者，其中46名RA患者富含丁酸盐，而对照组中只有5名消费者富含丁酸盐，这表明RA患者肠道中丁酸盐的消耗菌群增加( 图2A).对成对样本之间每种物种的代表性频率（样本中是否存在）进行了更严格的测试，确定了由57个类群相关物种组成的更为严格的群体（Kolmogorov-Smirnov检验， P <0.0001； 表S4），包括38.6%（57个中的22个）丁酸代谢物种。 根据这个小组，在类风湿关节炎患者中发现了更显著的丁酸盐消费者富集（类风湿关节炎，19种与健康对照，1种）( 图2B)类风湿关节炎患者中丁酸盐生产商和消费者的总丰度也分别显著降低和显著增加（Mann Whitney 美国 测试， P <0.05； 图2C)提示类风湿关节炎丁酸代谢明显紊乱。
图2 类风湿关节炎患者和NORA队列对照的微生物丁酸代谢。
( A )用准配对队列法（Wilcoxon符号秩检验）鉴定RA相关丁酸代谢物种的丰度， P <0.0001）。 颜色条指示 Z 分数-标准化丰度（按行缩放）； 蓝色和橙色分别代表丁酸盐生产商和丁酸盐消费者。 ( B )准配对队列（Kolmogorov-Smirnov检验）确定的RA相关物种中丁酸盐生产商和消费者的数量， P <0.0001）。 ( C )丁酸盐生产商、丁酸盐消费者的总丰度及其在患者和对照组中的比率。 健康对照组（HC）， n =29； 类风湿关节炎组（RA）， n =25。 Wilcoxon秩和检验* P <0.05和** P <0.01。
类风湿关节炎中与全身炎症和自身抗体产生相关的核心丁酸代谢物质 ACPA的存在与更严重的关节畸形和预后差有关( 1)因此，我们询问丁酸代谢物种是否与自身抗体的产生有关。 采用准配对队列方法，对来自NORA队列的25例ACPA阳性治疗患者和15例ACPA阴性RA患者进行比较（表S1），我们确定了92个ACPA相关物种（表S5；配对样本的Wilcoxon符号秩次检验， P <0.0001）； 92例中37例（40.2%）为丁酸代谢产物。 其中，64.9%（24/37）的丁酸盐消费者和2.7%（1/37）的丁酸盐生产商富集在ACPA（+）组，而32.4%（12/37）的丁酸盐生产商富含ACPA( ?) 没有强化丁酸盐消费者的群体( 图3A以及图S2）。 丁酸代谢物种的比例（92个物种中的37个，40%）远高于它们在肠道基因组中通常所占的比例。 此外，专家组中与ACPA相关的丁酸盐生产商和消费者显示出与临床特征截然相反的相关性（Spearman相关性； 图3A)这些丁酸盐生产者和消费者的总丰度在ACPA之间也表现出显著差异( ?) ACPA（+）患者( 图3B; P <0.005）。 因此，基于上述观察结果和其他研究评估的丁酸盐抗炎作用，我们将ACPA相关物种小组中的12个丁酸盐生产商和24个丁酸盐消费者定义为RA相关物种的核心小组（表S5）( 16– 18).
图3 肠道丁酸代谢与ACPA状态有关。
( A )ACPA相关物种及其相关的全身炎症和自身抗体滴度的临床标志物列表。 彩色条表示斯皮尔曼系数，ρ>0，正相关。 ρ<0，负相关* ρ>0.4或ρ< ? 0.4** ρ>0 ? 0.5*** ρ>0 ? 0.6。 蓝色、橙色和黑色的物种名称代表丁酸盐生产商、丁酸盐消费者和非丁酸代谢物种。 抗瓜氨酸蛋白抗体； 抗CCP，抗环瓜氨酸肽； C反应蛋白； 血沉、血沉； 类风湿因子； DAS28，用ESR、DA28-ESR、CRP和DAS28-CRP计算疾病活动性评分。 ( B )ACPA相关物种面板中丁酸盐生产者和丁酸消费者的总丰度及其在ACPA中的比率（生产者/消费者）( ?) 和ACPA（+）亚组。 Wilcoxon秩和检验** P <0.01和*** P <0.001。 ( C )生产者/消费者比率与全身炎症临床标志物和自身抗体滴度的负相关。 每个点表示一个主题。 蓝色实线表示线性回归曲线。 ( D )ACPA状态随机森林分类器的性能基于ACPA相关物种面板中36种丁酸盐代谢物种的丰度，通过接收器操作曲线（ROC）和1000个引导重复进行评估。 曲线下面积。 ( E )随机森林模型的主要贡献物种。 小提琴表明在1000个引导重复中，基尼分数下降，方框中的中间线代表基尼分数下降的平均值。 蓝色和橙色分别代表丁酸盐生产商和丁酸盐消费者。
我们进一步研究了类风湿关节炎的核心指标与临床指标的相关性。 核心种丁酸盐生产商与消费者的比率与类风湿关节炎的各种临床表现和自身抗体滴度呈显著负相关( 图3C)然后，以样本中36个物种的丰度为输入，构建了一个随机森林分类器，该分类器在区分ACPA方面表现出良好的性能( ?) 患者来自ACPA（+）患者，在受试者操作特性（ROC）曲线评估中曲线下面积（AUC）为0.94( 图3D)当以降低的基尼评分（表明每个物种对模型的贡献）排序时，排名靠前的物种包括丁酸盐生产商和丁酸盐消费者( 图3E)表明他们都参与了确定ACPA的状态。
核心丁酸代谢产物提示类风湿关节炎的骨侵蚀和关节畸形 为了验证丁酸代谢物质在类风湿关节炎中的作用，我们将另外37例类风湿关节炎患者和匹配良好的健康人纳入研究( n =31； 表S6和 图1)尤其是那些有关节腐蚀的。 如所示 图4A，与对照组相比，成熟类风湿关节炎患者的丁酸生产商与消费者的比率显著降低，这一点在所有受试者的SCFAs靶向代谢谱中与对照组相比，血清和粪便中的丁酸水平均显著降低（Mann Whitney 美国 测试， P <0.05； 图4B图S3）。 接下来，我们将已建立的患者分为DJ（畸形关节； n =13）和NDJ（无关节变形；诊断后2年， n =20）分组，并比较了ACPA相关丁酸盐生产或消费物种的总丰度。 DJ患者的生产者/消费者比率显著降低( 图4C)与靶向测量中显著升高的血清和粪便丁酸盐浓度一致（Mann Whitney 美国 测试， P <0.05； 图4D).
图4 确定类风湿关节炎患者的肠道丁酸代谢。
( A )两组受试者中与RA相关的丁酸盐生产商、丁酸盐消费者的总丰度以及生产者/消费者比率。 RA，既往RA患者； 健康对照组。 ( B )RA和HC受试者的血清和粪便丁酸浓度。 ( C )ACPA相关面板中丁酸盐生产商和消费者的总丰度以及NDJ和DJ患者的生产者/消费者比率。 DJ，关节畸形患者； 无关节畸形的病人。 ( D )NDJ和DJ患者血清和粪便中丁酸的浓度。 ( E )ACPA相关面板中丁酸代谢物种的丰度与全身炎症的临床标志物、自身抗体滴度和畸形关节计数的相关性。 彩色条表示斯皮尔曼系数，ρ>0，正相关。 ρ<0，负相关* ρ>0.4或ρ< ? 0.4** ρ>0.5或ρ< ? 0.5*** ρ>0.6或ρ< ? 0.6。 蓝色和橙色的物种名称代表丁酸盐生产商和丁酸盐消费者。 DJC/年，按病程标准化的变形关节数。 ( F )由ACPA状态训练的随机森林模型的性能（参见 图2D)以1000个自举重复的ROC评估已建立患者的关节畸形发展。 ( G )高血沉患者血清和粪便中丁酸盐浓度的比较 ≥ 2.6）和低疾病活动性（DAS28-ESR<2.6）。 ( H )粪丁酸水平与DJC的关系。 实线表示线性回归曲线。
丁酸盐的产生影响类风湿关节炎的炎症状态 在验证队列中，ACPA相关小组中的丁酸盐生产商和丁酸盐消费者也表现出与炎症标志物和按疾病持续时间标准化的畸形关节数量的反向相关性（Spearman的相关性； 图4E).随机森林模型被训练用于区分NORA队列中ACPA状态与ACPA相关面板中36种丁酸代谢物种的丰度，由验证队列进行测试，以预测既定RA患者的结果，即他们是否出现关节变形。 该模型用ROC对DJ组和NDJ组患者进行判别，准确率为0.986( 图4F)提示ACPA的产生和关节糜烂均与肠道丁酸代谢有关。 结果表明，在血清中，dara活性（dara-2）活性明显高于疾病患者的dara-2活性 ≥ 2.6）（曼惠特尼 美国 测试， P <0.005； 图4G)类风湿关节炎患者粪丁酸水平与关节畸形数呈负相关( P <0.001； 图4H).
丁酸盐抑制RA患者破骨细胞分化 由于在DJ患者中，丁酸盐的生产者/消费者比率显著降低，我们随后检查了丁酸盐是否影响类风湿关节炎的骨破坏。 在这项研究中，人类数据表明RA患者的粪便和血清丁酸水平较低，Rankl是破骨细胞信号的重要组成部分（Mann Whitney 美国 测试， P <0.05； 图S4，A和B）。 在体外，破骨细胞分化试验显示丁酸盐抑制破骨细胞的分化（图S4、C和D），这与最近的研究一致( 19)显示肠道微生物代谢物补充对骨修复的潜在意义。 在机械上，丁酸盐给药导致破骨细胞分化（图S5）和组蛋白脱乙酰酶（HDAC）减少（图S4、E和F）的KEGG（京都基因和基因组百科全书）途径的变化。 总之，这些结果表明丁酸盐改变了类风湿关节炎破骨细胞的分化，并防止了骨破坏。
丁酸直接促进T 规则 极化与抑制T 转换 促炎细胞因子 为了进一步探讨肠道丁酸盐代谢对自身抗体产生的影响机制，我们对循环CD4亚型进行了评估 + T细胞[包括T细胞 雷格斯 ，吨 FH公司 ，T助手17（T H 17） ，吨 H 1和T H 2] 类风湿关节炎患者。 我们观察到循环性T细胞比例显著增高 雷格斯 类风湿关节炎患者大便丁酸水平高（Mann Whitney 美国 测试， P =0.0437； 图5A)我们还将丁酸盐与类风湿关节炎患者的外周血单个核细胞（PBMCs）共培养，发现丁酸盐与RA患者外周血单个核细胞的比例 雷格斯 增加了( 图5B)还有T FH公司 还有T H 17个细胞明显减少( 图5，C和D)，但不是T H 1和T H 2个电池。
图5 丁酸盐上调T 雷格斯 并下调T H 17和T FH公司 细胞。
( A )循环温度 雷格斯 （%）粪便丁酸盐浓度高或低的患者[根据粪便丁酸盐水平的95%置信区间（1429至2244），临界值为1825μg/mg]。 ( B 到 D )T的百分比变化 雷格斯 （B） ，吨 FH公司 细胞（C）和T H 17（D）与RA患者外周血单个核细胞共培养后。 ( E )新分离T细胞已知差异表达基因的文氏图 雷格斯 和传统的T H 细胞（T 转换 ). ( F )描述丁酸盐刺激PBMCs前后转录折叠变化的火山图( n =3）与 P 价值观。 ( G )热图 转换 T细胞分化相关基因 雷格斯 还有T 转换 给药前（0）和给药后（1）。 ( H )类风湿关节炎发育相关基因的热图 雷格斯 还有T 转换 丁酸盐给药前后。 0，丁酸盐给药前； 1、丁酸盐给药后。
此外，为了了解丁酸盐是如何支持T 规则 CD4分化 + 从RA患者外周血单个核细胞中分离T细胞，用丁酸盐处理4d，观察T细胞在调节RA中的差异 法规 和效应器T 转换 （传统T H 细胞）用RNA测序（RNA-seq）进行评价。 在T 雷格斯 还有T 转换 出人意料的不同( 图5E)只有39.4%的基因是共享的。 微分表达式显示在火山图中( 图5F)。如预期，T 雷格斯 与T 雷格斯 丁酸盐给药后，T 卷积和多项式相乘 分化( 图5G)和RA发展( 图5H)这些基因是已知的 FH公司 ，吨 H 17，吨 H 1，吨 H 2，以及相关的自身免疫基因（图S6和S7），这表明丁酸盐不仅可以促进T 雷格斯 同时也抑制了T 转换 以及炎症细胞因子，可能有助于免疫系统的止血。 特别是某些HDAC亚型在T 雷格斯 由于施用丁酸盐（图S8）。 总之，这些数据表明丁酸盐选择性地促进了T 雷格斯 抑制了T 转换 提示类风湿关节炎对免疫平衡有重要影响。
丁酸盐通过调节细胞和体液免疫反应抑制CIA小鼠关节炎 接下来，我们利用胶原诱导关节炎（CIA）模型来研究丁酸盐在体内对RA的保护作用。 在胶原蛋白免疫的第一天就开始了富含丁酸盐的饮食( 图6A)与正常饮食的对照CIA小鼠相比，添加丁酸盐显著增加粪便和血液中的丁酸水平( P <0.05； 图S10），伴随着关节炎总发病率显著降低（11%对85%， P <0.01），关节炎症严重程度降低( P <0.05）和轻度关节炎，以缺乏骨质破坏为特征( 图6，B至E).
图6 丁酸盐抑制免疫反应，减少小鼠关节炎症和骨破坏。
( A )以丁酸盐为基础的预防方案的实验设计采用经典的CIA小鼠RA模型。 ( B 和 C )添加或不添加丁酸盐（But）的CIA小鼠关节炎发病率和评分。 中情局， n =19； 但是， n =19。 ( D )关节炎和爪骨侵蚀的显微CT图像（顶部和中部）以及苏木精和伊红（H&E）染色（底部）分析。 ( E )足爪组织病理学评分。 控制，控制。 比例尺，200μm。 n =每组10个。 ( F 到 H )血清IL-10（F）、IL-6（G）和抗II型胶原抗体（H）的浓度。 n =每组19个。 ( 我 到 我 )具有代表性的流式细胞术图表，显示CD4的频率 + CD44细胞 + CD25 + Foxp3型 + T 雷格斯 （I和J）和CD4 + CD44细胞 + CXCR5型 + PD1 + Bcl6公司 + T FH公司 细胞（K和L）。 反对的论点， n =9； 中情局， n =8至14； 但是， n =8到14。 这里用两个独立的实验数据来表示。 显著性通过Kaplan-Meier分析和log-rank检验（B）、双向方差分析和Tukey的多重比较检验（C）或Mann-Whitney来确定 美国 试验（E-L）* P <0.05和** P <0.01。
与对照组CIA小鼠相比，添加丁酸盐的小鼠血清白细胞介素-10（IL-10）水平显著升高（111.9±6.099pg/ml，53.1±12.71pg/ml， P <0.01），血清IL-6水平显著降低（41.88±11.74 pg/ml对91.14±18.75 pg/ml， P <0.01）和自身抗体（1.752±0.1009×10） 4 U/ml与2.239±0.04373×10 4 单位/毫升， P <0.01）( 图6，F至H)流式细胞术分析显示，添加丁酸盐可显著增加CD4的比例 + CD25 + Foxp3型 + T 雷格斯 在两个关节引流淋巴结（DLNs）( P <0.01； 图6I)还有派尔的贴片( P <0.01； 图6J)降低了CD4的比例 + CD44细胞 + CXCR5型 + PD-1型 + Bcl6公司 + T FH公司 两个关节引流淋巴结的细胞( P <0.01； 图6K)还有派尔的贴片( P <0.01； 图6L)，与先前报道的丁酸盐对T细胞亚群调节作用一致( 18, 20, 21)滤泡调节性T（T 法国 )已知细胞能抑制T细胞 FH公司 细胞分化与生发中心形成( 22, 23)在CIA小鼠中补充丁酸盐也显著增加了CD4的数量 + CD44细胞 + CXCR5型 + PD-1型 + Foxp3型 + T 法国 细胞，尤其是在DLN中（图S10，A和B）。 此外，我们还发现B220的比例显著下降 + CD4细胞 ? CD95型 + GL-7型 + 生发中心B细胞( P <0.005； 图S10，C和D）。 这些结果证实了肠道丁酸盐对类风湿关节炎的保护作用。
讨论 我们的研究提供了证据，调整肠道微生物群，增加丁酸产生种类和减少丁酸消耗，可以增加丁酸产量，并与轻度炎症状况和良好预后相关。
在这里，通过应用超敏分析方法准配对队列，我们确认了丁酸代谢物种在临床类风湿关节炎队列中的重要作用，并揭示了肠道丁酸盐消费者对最终丁酸盐浓度的贡献， 这突出了丁酸代谢的生产者和消费者双方对T 雷格斯 和效应器T 转换 我们还建立了一个物种小组，专门区分ACPA阳性和关节变形的患者。 尽管许多研究已经确定了丁酸盐如何影响肠道上皮和免疫系统的分子机制，这可能对类风湿关节炎或其他自身免疫性疾病有益( 2– 4, 10, 24– 26)，仍然迫切需要证据证明其在临床研究中的保护作用和过程的描述。
以前的研究报道类风湿关节炎患者的粪便丁酸盐显著减少。 在人体肠道中，丁酸盐生产商和消费者之间的相互作用维持着动态平衡。 丁酸盐消费品，如 假单胞菌 通常是强壮的，即使没有碳水化合物供应也能在恶劣的环境中生存。 这些物种可以生活在各种碳源上，如丁酸盐、乳酸盐、醋酸盐等。 丁酸盐是摄取高热量的最佳营养素之一，但对它们的生存来说却不是必需的。 肠道中的丁酸盐主要由产丁酸的物种提供，但如果不足够，丁酸盐的消费者可以使用其他营养物质来生存。
我们的研究结果表明，在类风湿关节炎患者中，产生丁酸盐的细菌数量明显增加，DJC和ACPA（+）的发生率较低，提示丁酸盐在减轻炎症方面有潜在作用。 我们发现，根据生产者和消费者之间的比率得出的净丁酸盐产量，以及代谢物测量值，与疾病活动性、抗体产生和关节畸形呈负相关，这进一步巩固了丁酸盐对类风湿关节炎的保护作用。
丁酸盐对抑制CIA至关重要，可能是通过T 规则 /白介素-10/T H 17轴( 27)或者通过B细胞调节( 28)我们的研究表明，丁酸盐含量高与T 雷格斯 类风湿关节炎患者。 我们发现的另一个方面是，单独的丁酸盐饮食可以保护CIA小鼠对抗关节炎，同时促进T 雷格斯 抑制T FH公司 派尔斑和关节引流淋巴结中的细胞。 在这方面，我们和其他人已经报告说，存在的循环T FH公司 血液中的细胞表明自身免疫状态和疾病激活，包括RA和系统性红斑狼疮（SLE）( 23)我们要强调的是，除了丁酸盐对T 雷格斯 ，对效应器T的影响 转换 ，如T FH公司 细胞是特定的。 T的主要功能 FH公司 而GCB等自身免疫细胞则是促使患者体内的自身免疫细胞分化为记忆细胞。 因此，我们最终确定，肠道丁酸盐暴露可能通过影响T细胞分化至止血作用，恢复免疫平衡，抑制局部自身免疫，如肠道或远处的组织靶点，如关节炎。 所有这些事实表明，丁酸盐可以扑灭类风湿关节炎患者的炎症，并预示着未来的治疗应用。 丁酸盐抑制破骨细胞分化，加重RA关节畸形。 因此，我们的数据显示丁酸盐在保护关节不变形方面的多重功效，与先前的研究结果一致( 28).
然而，与ACPA相关的丁酸代谢物种的相对丰度非常低。 丁酸产生菌的丰度从回肠的主要栖息地沿结肠逐渐减少。 当我们在这项研究中使用粪便样本时，我们检测到的丁酸盐产生者只是它们在肠道中大量繁殖的一部分。 然而，组间粪便丁酸盐产生者的差异可能表明，在上结肠，这些物种在微生物区系中占相当大的比例，并以生理相关的方式促成血清和粪便丁酸盐的变化。 遗憾的是，目前的元基因组研究无法确定每个个体中丁酸代谢细菌的绝对数量，因为常规的宏基因组研究中没有添加内部参考，也不方便获取回盲部的微生物组样本。
总之，类风湿关节炎患者的宏基因组和代谢分析确定了一个共同的丁酸代谢物种面板，在机制上与ACPA状态和关节畸形的结果有关，这支持微生物来源的肠道丁酸盐在类风湿关节炎的全身免疫调节中起保护作用。 这些发现也为未来临床研究控制肠道丁酸盐代谢，通过饮食或微生物疗法改善类风湿关节炎患者的治疗提供了有力的理论依据。
材料和方法 研究设计和样本收集 这项研究招募了年龄在18至70岁之间的男性和女性患者，这些患者根据2010年美国风湿病学会和欧洲抗风湿病联盟（EULAR）分类标准诊断。 如果有其他急性或慢性疾病，则排除在外。 队列I（NORA）包括40名治疗初期RA患者（25名ACPA阳性RA患者和15名ACPA阴性RA患者）和29名年龄和性别匹配的健康个体（表S1）。 队列II（确定RA）包括37例接受标准治疗的RA患者和31例年龄和性别匹配的健康对照组（表S6和 图1)本研究依据《赫尔辛基宣言》和《国际协调良好临床实践指南会议》的规定，经北京大学人民医院伦理委员会批准。 试验方案和所有相关研究表格均已由北京大学人民医院机构评审委员会批准（批准号：2016PHB200）。 所有患者均提供书面知情同意书。
宏基因组学测序与注释 所有粪便样本在北京大学人民医院采集，冷冻后运至中国科学院北京基因组研究所，保存于 ? 80°C用于后续的亚基因组测序。 我们使用E.Z.N.A.土壤DNA试剂盒（D5625-02，OMEGA）从粪便样本中提取DNA，并在Illumina Hiseq2000/2500平台上进行配对末端基因组测序[100碱基对（bp）/150 bp×2；插入大小，350 bp]。 原始读取随后被应用到质量控制中，模糊的序列和适配器被FastQC（版本0.11.5）过滤，低质量的基被Trimmomatic过滤( 29)（版本0.33，选项：滑动窗口：4:20最小长度：40）或FASTX工具箱( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/commandline.html，版本0.0.13，选项：-q 20-p 80）。 然后，由BWA（带有默认参数的mem模块）删除了与Hs37人类基因组对应的人类起源的读数( http://bio-bwa.sourceforge.net/)聚合酶链反应（PCR）复制品用PRINSEQ去除( http://prinseq.sourceforge.net/)使用-verbose-derep 1-derep_min 2选项。 最后的干净读取应用于分类法注释。 用Kraken进行微生物分类( http://ccb.jhu.edu/software/kraken/，1.0版，Kraken translate模块，选项--mpa格式），用于所有测序样本的干净数据，其中样本中所有物种的总相对丰度标准化为1。 极低丰度的物种（相对丰度<10 ? 5 )在极少数样本中（<10%的总样本）被移除，以避免随机关联。 每个样本的功能分析都是用human2进行的( http://huttenhower.sph.harvard.edu/humann2)，它将读取数据映射到默认的功能注释泛基因组数据库（ChocoPhlAn数据库），并识别基因家族（UniRef数据库）和潜在代谢途径（MetaCyc数据库集合， https://biocyc.org/)微生物群落。
拟配对队列的构建 如前所述，构建准配对队列( 10)，除了一些修改。 简单地说，首先构建了一个高维空间，其中每个物种的丰度代表一个维度，所有受试者都根据其物种分布在空间中。 因此，样本形成了一个基于欧几里德距离的相似度网络。 下一步是寻找边界样本，这对定义表型组之间的边界至关重要。 边界样本是那些表现出与相对群的样本比同一组中的样本具有更高物种剖面相似性的样本，即在高维空间中，与邻域的距离比相对群的成员长。 为了寻找边界样本，每个样本的相似度与其最近的 k 邻域首先被计算为KNN（平均欧几里德距离到 k 最近的邻居），在哪里 k 是样本量的平方根。 然后，去除距离相邻点太远（KNN>mean KNN+SD）的异常值和离相邻点太近（KNN<mean KNN-SD）的冗余，以避免随机影响。 最后，选择组内KNN>组间KNN作为两组的边界样本。 每个边界样本被用来构建 k 样本对及其 k 对侧的最近邻，这些对被用来构成成对样本的队列，其中每对样本具有相似的物种特征（高维空间中的最近邻），但表型相反。 去除冗余对后，最终重建准成对队列。
丁酸代谢产物的鉴定 对于丁酸盐生产商来说，至关重要 等等。 ( 14)共检索了3184个细菌基因组，根据丁酸基因途径中所有必需基因的存在以及这些基因的同源性，鉴定出225种细菌有可能产生丁酸盐。 这225种细菌隶属于131种，在同一种菌株中表现出明显的一致性。 因此，我们将样本中的注释物种归类为丁酸盐生产商，如果它们在之前出版物提供的131种丁酸物种列表中。
对于丁酸盐消费者，目前还没有此类报告提供丁酸盐消费的微生物种类的明确清单。 齐尔斯 等等。 ( 15)确定了微生物降解丁酸盐催化丁酸反应的关键基因 ? 辅酶（辅酶） ? 3-羟基丁酸酯。 第一步为酰基辅酶A脱氢酶或丁酰辅酶A脱氢酶，第二步为烯醇基辅酶A水合酶或巴豆酰辅酶A水合酶。 因此，我们根据KEGG数据库筛选了所有物种的公开存储基因组，并根据KEGG数据库对这四个基因的存在进行了注释，并确定了携带这两个步骤酶的基因组是潜在的丁酸盐消费者，属于185个物种。 我们注意到，许多丁酸盐生产商也含有丁酸盐消耗基因，这表明他们有能力利用自己合成的丁酸盐； 这些物种仍被归为生产者。 本研究样本中确定的所有丁酸盐生产和消耗物种列于表S3中。
随机森林模型在诊断能力评估中的应用 以12种丁酸盐生产树种和24种丁酸消费树种的丰度为输入，建立了随机森林模型( https://cran.r-project.org/web/packages/caret/)还有randomForest R软件包( https://cran.r-project.org/web/packages/randomForest/index.html)然后，通过R-packages-pROC，用AUC和准确度评估了面板中丁酸盐种类的诊断能力( https://cran.r-project.org/web/packages/pROC/index.html)还有ROCR( https://cran.r-project.org/web/packages/ROCR/index.html)鉴别NDJ患者ACPA状态和DJ。 用40%的样本进行二次交叉验证，并以所有样本作为测试数据集来评估诊断能力。 对1000个自举复制和物种重复该过程，并记录每个重复的基尼评分下降情况。
CIA诱导和丁酸盐干预 雄性DBA/1小鼠（6~8周龄）从华富康（北京）有限公司购买，在特定的无病原体条件下喂养。 所有实验均按照北京大学人民医院动物保护与使用委员会规定的指南进行。 CIA诱导是根据先前公布的方案进行的( 30)简单地说，用150μg牛II型胶原蛋白（CII；Chondrex，Redmond，WA，USA）在完全弗氏佐剂（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）中乳化，在尾端底部皮肤内免疫DBA/1小鼠。 21天后，用75μg的CII乳化在弗氏不完全佐剂（Sigma-Aldrich）中进行强化免疫。 临床评分在强化免疫后使用以下系统进行评估( 30)：0，正常； 1、一指或数指红斑、肿胀； 2、红斑、中度肿胀，从踝关节向足中段（跗骨）； 3、从踝关节至跖骨关节出现红斑和严重肿胀； 4、脚踝、足部和手指周围出现完全红斑和肿胀，导致畸形和/或强直。 所有四肢的得分相加，得出每只老鼠的总分为0到16分。
我们将小鼠随机分为两组，丁酸饮食组和对照组。 在初次免疫后（第1天）和整个实验期间，所有小鼠均饲喂含有20%（w/w）丁酸盐[20%（w/w）、均匀混合在饲料中的丁酸盐、HFK Bioscience Co.Ltd.）或常规饲料（HFK Bioscience Co.Ltd.）。 在研究终点，对小鼠实施安乐死，收集血清样本进行细胞因子和自身抗体检测。 取小鼠脾脏、关节引流淋巴结（腘窝和腋窝淋巴结，DLN）、派尔斑片和肠系膜淋巴结，通过70μm细胞过滤器（Corning）在含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基和单细胞悬浮液（10%）中进行筛选 6 细胞/100μl）制备流式细胞仪。
射线照相评估和组织学分析 收集每只老鼠的爪子并将其固定在4%多聚甲醛中48小时，然后使用微型CT扫描仪（Quantum FX，Caliper，USA）进行扫描。 然后，用5%EDTA脱钙，石蜡包埋，切片，苏木精和伊红染色。 对矢状切面进行显微镜评估，并根据以下先前报告的参数对组织病理学变化进行评分( 31)：0，滑膜正常； 滑膜肥大，细胞浸润； 血管紧张和软骨糜烂； 软骨和软骨下骨严重糜烂； 4、关节完整性丧失，关节强直。 所有四肢的得分相加并除以4，得出每只老鼠的平均得分为0到4。
流式细胞仪分析 首先对细胞表面标记物进行染色，然后按照制造商的方案用细胞内染色缓冲液组（Thermo Fisher Scientific）固定、渗透，并用细胞内或核内标记物染色。 如表S7所示，抗体从BD Biosciences（加利福尼亚州圣何塞市，美国）、eBioscience（Thermo Fisher Scientific）或BioLegend（美国加利福尼亚州圣何塞）购买。 T 雷格斯 定义为CD4 + CD25 + FOXP3型 + ，吨 FH公司 CD4细胞 + CD44细胞 + CXCR5型 + PD-1型 + Bcl6公司 + ，吨 法国 CD4细胞 + CD44细胞 + CXCR5型 + PD-1型 + Foxp3型 + ，GCB电池为B220 + CD4-CD95 + GL-7型 + 详细的选通策略见图S11。 流式细胞术使用FACSAria II（BD Biosciences）进行，数据使用FlowJo v10进行分析。 0.7软件（美国阿什兰州Tree Star公司）。
破骨细胞培养 用Ficoll分离法从正常人、健康献血者和RA患者的血液中分离出单核细胞。 收集的细胞在含有10%FBS、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100μg/ml）的α-最低基本培养基（Thermo Fisher Scientific）中重新悬浮，并在24孔平板中放置7至9天。 为了确定丁酸盐对破骨细胞发育的影响，我们用1000μM丁酸盐或不添加丁酸盐培养单核细胞。 用巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）（30 ng/ml）和核因子-κB配体受体激活剂（RANKL）（50 ng/ml；中国上海研发系统）在破骨细胞中分化成熟。 每隔3天将培养基和细胞因子完全清除并更换。 在培养结束时采集细胞进行PCR扩增。
体外细胞培养及丁酸盐刺激 用密度梯度离心法分离出24例mcs。 随后，细胞在RPMI 1640中培养，RPMI 1640中添加10%FBS和1%青霉素链霉素和5%CO 2 在37℃下，添加1000μg/ml丁酸盐以刺激细胞。 三天后，细胞在含2%FBS的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤，并用如下结合抗体染色：抗CD3–周环蛋白叶绿素蛋白（PerCP）、抗CD4–异硫氰酸荧光素（FITC）、抗CD25–藻红蛋白（PE）和抗CD127–灿烂紫605（BV605）。 在黑暗中孵育30分钟后，T 雷格斯 （CD25） + 川地127 ? )还有T 转换 （CD4 + CD25 ? )使用Astrios EQ流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司）进行分类和纯化。
RNA序列分析 对新鲜T 雷格斯 （CD25） + 川地127 ? )还有T 转换 （CD4 + CD25 ? )同一供体在丁酸盐共培养前后产生。 简单地说，RNA序列库是使用Illumina TruSeq绞合总RNA试剂盒（Illumina，San Diego，CA，USA）生成的。 通过过滤核糖体RNA（rRNA）读取、测序适配器、短片段读取和其他低质量读取，对原始测序读数进行预处理。 我们使用Hisat2（版本：2.0.4）将干净读数映射到有两个不匹配的人类hg38参考基因组。 在基因组图谱绘制之后，StringTie（1.3.0版）与一个参考注释一起运行，为已知的基因模型生成FPKM（每百万个外显子模型千碱基的读数）。 差异表达基因用edge R进行鉴定 P 多个测试中的值由FDR设置。
实时定量PCR 共1×10 5 PBMC衍生T 雷格斯 或分离的破骨细胞前体进行分类，并按照制造商的说明（天根）采集RNA。 用总RNA（0.5μg）制备第一链互补DNA（cDNA），作为两步反转录PCR的起始步骤。 对于实时PCR，SYBR Green Master Mix与ViiA 7系统（应用生物系统）一起使用。 使用了以下引物：HDAC1、atccgcatgactcatatttgc（sense）和ggatggaggcaagattataat（反义）； HDAC2，aaagtctgctactactagacg（sense）和ttatggtcatgcgattat（反义）； HDAC3、ttcaataccctctctcgtgc（sense）和aggtttcaaagattgtctggc（反义）； HDAC4、gccaagatgacttcctctta（sense）和tttcggccatttctgctttag（反义）； HDAC5、ctacgacgtttcatgctaaag（sense）和CACTGTCTGGATCTCATCTAGC（反义）； HDAC6、gtgtcacttcgaaggaatat（sense）和ccacgatggtcttcttcat（反义）； HDAC7，ctcaaactggacacggaag（sense）和aatgagtcattccaggatggt（反义）； HDAC8、tgctgtcctgggaatattacctgc（sense）和aactgaatgcgttcttctcacatctc（反义）； HDAC9、accttcttctttgcccacattac（sense）和ggaacccttgcctaaggctctg（反义）； HDAC10、gcttgtgtacatgagacat（sense）和cagtgaagctctgtgca（反义）； 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GADPH）、TGCACACACTGCTTAGC（sense）和GGCATGGACTGTGGTCATGAG（反义）。
代谢组学分析 利用气相色谱法对粪便和血液进行SCFA分析。 SCFA分析包括以下脂肪酸：乙酸（C2:0）、丙酸（C3:0）、异丁酸（C4:0I）、丁酸（C4:0N）、异戊酸（C5:0I）、戊酸（C5:0N）、异己二酸（C6:0I）、己酸（C6:0N）和庚酸（C7:0）。 使用安捷伦技术1260 A气相色谱系统和火焰离子化检测器进行色谱分析。 采用自由脂肪酸相（30m×0.53mm×0.5μm）的熔融石英毛细管柱。 以14.4ml/min的流速供给氢气作为载气。初始温度为100℃，保持0.5min，然后以8℃/min的速度升至180℃，并保持1min。然后，以20℃/min的速度将温度升至200℃，最后在200℃保持5min。注入量为1μl， 每次分析的运行时间为17.5min。
利用代谢分析仪进一步分析与代谢物浓度相对应的积分峰面积( www.metaboanalyst。加利福尼亚州)代谢物丰度表示为相对于内标物。
细胞因子和自身抗体检测 用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（Multisciences）测定细胞因子（IL-6和IL-10）浓度，用小鼠抗牛Ⅱ型胶原IgG抗体检测试剂盒（Chondrex）检测胶原特异性抗体效价。 所有测量均遵循制造商说明中所述的套件协议。
统计分析 R包装素食主义者( https://cran.r-project.org/web/packages/vegan/index.html)对微生物群落的α多样性和β多样性进行了分析。 用Simpson指数、Shannon指数和均匀度（Pielou指数）来表示多样性。 用ADONIS〔置换多元方差分析（PERMANOVA）〕对Bray-Curtis相异距离的主坐标分析（PcoA）进行了分析( https://cran.r-project.org/web/packages/PERMANOVA/index.html)表示β多样性。 用Mann-Whitney检验各组间丰度差异的显著性 美国 用 P 由Benjamini和Hochberg方法调整的值。 对于准配对队列中的配对样本，用Wilcoxon符号秩检验检验物种丰度的统计显著性，用单侧Kolmogorov-Smirnov检验检验物种存在频率的差异。 用Spearman秩相关检验或线性回归分析物种丰度与临床标志物的相关性。
实验中，采用双向方差分析（ANOVA）、Tukey多重比较检验和Kaplan-Meier对数秩检验确定各组关节炎评分和发病率的差异。 用Mann-Whitney分析两组间细胞因子、抗体或淋巴细胞的差异 美国 非参数检验。 在GrapV7中进行统计分析。 00软件（GraphPad，加利福尼亚州圣地亚哥，美国）。 双面A P <0.05的值被认为具有统计学意义。
