Light-Seq:难访问细胞的全转录组测序

一种新的DNA纳米技术驱动的方法叫做Light-seq，可以对完整组织中难以访问的细胞进行全转录组测序。研究人员用专属于少数感兴趣细胞的独特DNA条形码对全部RNA序列进行“地理标记”。这些靶细胞在显微镜下通过快速有效的光交联过程选择。来自Wyss研究所的发明者正在寻求一条将该技术商业化的道路。

　　

一种新的空间转录组学技术——被称为“Light- seq”的DNA纳米技术驱动的方法——允许研究人员用专属于少数感兴趣细胞的独特DNA条形码对全部RNA序列进行“地理标记”。这些靶细胞在显微镜下通过光交联过程选择。

在DNA纳米技术的帮助下，条形码RNA序列被翻译成连贯的DNA链，然后可以从组织样本中收集并使用下一代测序(NGS)进行识别。Light-Seq过程可以在相同的样本中对不同的细胞群使用不同的条形码进行重复，并保留原样以供后续分析。

这项工作发表在《自然方法》杂志上。

“Light-Seq独特的特征组合填补了一个未满足的需求:对保存的组织中难以分离的细胞群或罕见细胞类型进行图像信息、空间规定、深度测序分析的能力，并将其高度细化的基因表达状态与空间、形态和潜在疾病相关的特征一一对应，”Wyss研究所的核心教师Peng Yin博士说。

 

为了能够对小鼠视网膜各功能层(左图)中神经元细胞的RNA分子进行特异测序，研究小组应用了一种新的方法，将DNA条形码“光交联”到视网膜各光选择层(如洋红色、浅蓝色和绿色所示)的RNA分子拷贝上。然后，他们使用DNA纳米技术驱动的拼接技术生成连续序列，可以从组织中轻度提取，并最终通过NGS读取。横截面保持完整，并用于后续定位由RNA分子编码的蛋白质，这些RNA分子在单个层中富集。[哈佛大学威斯研究所]

此前，Yin的团队已经开发了空间转录组学方法SABER-FISH，用于直接成像完整组织中的基因表达。“有了SABER-FISH，我们距离捕获细胞完整的基因表达程序还有好几个数量级，因为每个细胞都有数千个不同的RNA分子。RNA分子太密集了，用目前的成像技术无法完整捕捉到它们，”技术开发人员Jocelyn Kishi博士指出。“Light-Seq通过NGS将高分辨率条形码标记与全转录组测序相结合，解决了这个问题，为我们提供了最好的两个世界和额外的关键优势。”

 

Yin团队的博士后Ninning Liu博士说:“为了在完整组织样本的定制选择位置对细胞进行特定的测序，我们开发了一种新的方法，将DNA条形码光交联到RNA分子的副本，以及一种DNA纳米技术驱动的程序，使它们及其附加的RNA序列可被NGS读取。”

首先，DNA引物与细胞中的RNA分子形成“碱基对”，并被扩展以生成cDNA。然后，含有超快光交联子核苷酸的DNA条形码链与细胞内的cDNA进行碱基配对。当一个靶细胞在显微镜下通过一种模板状的光学装置被照亮时，这些细胞就会永久连接在一起，这种光学装置将显微镜下的其他非靶细胞置于黑暗中，从而使它们免受光交联反应的影响。在洗掉没有永久连接在原位的细胞中的条形码DNA序列后，可以用不同的条形码和光模式重复这一过程，以标记更多感兴趣的区域。

“为了能够将这种条形码工作流程与NGS集成，我们设计了一种基于DNA纳米技术的新的拼接反应。这项创新使我们能够将我们的条形码cDNA转换成连续的读出序列。然后，我们可以从样本中提取含有条形码的cDNA序列的完整集合，并使用标准的NGS技术进行分析，”Sinem Saka博士解释说。“最终，每个条形码都将完整的转录组读数追溯到组织样本中预先选择的细胞，这些细胞保持完整，以供后续分析。这为我们提供了一个独特的机会，在测序验证或进一步探索后重新访问完全相同的细胞。”

Yin的团队将Light-Seq应用于小鼠视网膜的横切面，以分析具有不同功能的三个主要层。研究人员达到了与单细胞测序方法相当的序列覆盖范围，并发现视网膜的三个主要层之间富集了数千个RNA。他们还表明，在序列提取后，组织样本保持完整，并可以进一步成像的蛋白质和其他生物分子。最后，研究小组成功分离出视网膜多巴胺能无分泌细胞的完整转录组，这是一种罕见的细胞类型，很难分离。

“我们的测序数据清楚地表明，Light-Seq可以确定RNA结构的自然变化。展望未来，我们对使用Light-Seq来更好地理解免疫系统、疾病传播细胞和不同治疗策略(如基因和细胞治疗)之间的相互作用非常感兴趣，”Kishi说，她正在与她的一些合著者一起寻求一条将Light-Seq商业化的道路。

Light-Seq: Light-directed in situ barcoding of biomolecules in fixed cells and tissues for spatially indexed sequencing