CAR-T治疗实体瘤的挑战和毒性控制

CAR T治疗实体瘤的挑战是什么？看看这篇来自网络的综述简单回顾一下。

　　

CAR-T全称为嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy）。其原理是在体外收集患者T淋巴细胞，通过基因工程修饰（添加嵌合抗原受体CAR结构域）来指导T细胞识别选定的抗原、增强其特异性识别肿瘤相关抗原的能力，提高其杀伤癌细胞的活性和持久性，从而绕过免疫库的局限和免疫耐受限制，通过为患者提供有效的人工免疫细胞，加速免疫的建立。体外扩增CAR-T细胞到足够数量，再将CAR-T细胞回输到患者体内，识别并清除肿瘤细胞。这种治疗创新基于基因工程、肿瘤免疫学和细胞制备的进展。

CD19是在大多数恶性B细胞表面发现的一种细胞表面分子。最初选择它作为CAR的靶点，而不是其他B细胞表面分子如CD20和CD22，主要是因为它的表达相对较高。基于CD19特异性CAR能消除小鼠白血病和淋巴瘤，美国国家癌症研究所和宾夕法尼亚大学对难治性/复发性（r/r）CD19+恶性肿瘤患者进行了临床试验。在非霍奇金淋巴瘤、急性和慢性白细胞淋巴瘤（NHL、CLL和ALL）中获得的结果令人鼓舞，并很快在几个较大的单中心和多中心研究中得到证实，掀起了CAR研究热潮。靶向CD19的嵌合抗原受体对于rrALL患者的缓解率高达90%，为肿瘤和其他医学领域的新免疫疗法开辟了道路。

2017年美国食品和药物管理局和2018年欧洲药品管理局批准的首批CARs疗法属于针对CD19的第二代CARs疗法。这些CAR分子包含CD28或4-1BB共刺激域(图1A)。到目前为止，多种CAR产品(Tisagenlecleucel, Axicabtagene ciloleucel, brexuctagene autoleuel, Lisocabtagene maraleucel)等被批准用于复发或难治(r/r)的儿童和年轻成人B细胞急性淋巴母细胞白血病、弥漫大B细胞淋巴瘤，高B细胞淋巴瘤，原发性纵腔大B细胞淋巴瘤，套细胞淋巴瘤和某些滤泡性淋巴瘤。

 

图1 CAR的结构、功能及设计。

(A)原型CD19 CAR。

(B)新颖的28z CAR设计。左:1928z CAR - T细胞在膜近端位置有一个功能单一的ITAM (1XX CAR)，显示增加的持续性，同时保留强大的效应功能。

右:含有截断的细胞质IL2Rb和YXXQ STAT3结合基元的CARs (28-ΔIL2RB-z(YXXQ) CAR)可以实现抗原诱导的JAK-STAT激活。

(C)新颖的BBz CAR设计。左:在4-1BB-based CAR (BBzz CAR)中，ITAM从3增加到6可以增强抗原敏感性和IL2分泌。

右图:改变4- 1bb为基础的CAR (BBz(86) CAR)的胞外和胞内结构域的长度可以减少细胞因子的分泌和CRS的严重程度。

 

CD19 CAR治疗的成功引发了人们对这种新型免疫疗法的广泛兴趣。目前，clinicaltrials.gov上列出了700多个临床试验，其中41%针对CD19，其余32%针对其他类型的血液恶性肿瘤，27%针对实体肿瘤。CD22和CD20已经被证明是B细胞恶性肿瘤的有效CAR靶点，尽管其程度低于CD19，而BCMA在多发性骨髓瘤的治疗方面显示出巨大的前景。BCMA CAR-T细胞已获FDA批准。这篇综述介绍了在肿瘤和其他领域实施CAR治疗的方向和挑战。

 

图2 CAR-T细胞临床试验总结。(A) CD19、其他血液学和实体恶性肿瘤的临床试验。根据clinicaltrial.gov(2021年3月):41%的全球临床试验使用CD19 CAR-T细胞，包括CD19和CD22 CAR-T细胞治疗的双重靶向。

(A)总共有32%的临床试验针对血癌，但不是CD19。总共有27%的临床试验针对实体肿瘤。

(B) CAR在血液学和实体肿瘤的临床研究中的靶点。基于临床试验gov(2021年3月):临床试验中用于指导CAR - T细胞的感兴趣抗原分布分析，显示cd19 scFv是主要的CAR - T(37%)，其次是抗bcma scFv(9%)。其他靶向其他血液学或非血液学抗原的CAR - T细胞比所有CAR - T临床试验落后不到4%。

(C)为CAR - t治疗设计的细胞类型。基于临床试验gov(2021年3月):大多数CAR - T细胞被αβ T细胞转导(>96%)。其他类型的细胞也在研究中，占上市临床试验的4%。这些细胞包括:γδ T细胞，NK和NK/T细胞，来自多能干细胞的免疫细胞，和单核细胞。

  

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CAR设计的演变

二代、三代、四代？
一代CAR主要是更换TCR识别域，第二代CAR-T疗法还将T细胞活化和生存必须的共刺激信号分子结构域CD28或4-1BB组装进CAR，从而使CAR-T细胞在体内的扩增能力和存活时间得到了提升，解决了早期CAR T细胞快速凋亡的问题。为了进一步提高CAR-T细胞在体内的存活率，第三代CAR-T疗法将共刺激信号域增加为一个以上，但是后继有研究表明多种共刺激结构域可能不会使第三代CAR更有效。二代CAR-T能够刺激类似于天然受体的CD3ζ的表达，而CD3ζ受体的活性取决于T细胞内结构域的大小，而不是依赖于共刺激分子的选择或者细胞外结构域的设计。第四代CAR-T疗法则加入了促炎性细胞因子或共刺激配体，以提升T细胞扩增活性和寿命，或者克服肿瘤免疫微环境的抑制。另外一些临床研究正在尝试设置“分子开关或基因开关”机制，试图控制CAR-T在体内的功效，必要时中止细胞因子释放，避免对机体的伤害。

目前的CAR包含一个用于抗原识别的单链Fv (scFv)和一个双信号尾，通常包含CD3 ζ和CD28或4-1BB胞浆结构域。已上市的两个CAR-T产品中，诺华的Kymriah用的是4-1BB共刺激信号，吉利德的Yescarta 使用CD28共刺激信号。从目前已经报道出来的长期的临床结果而言，疗效和安全性上两者并没有显著差异。有分析认为，CD28的信号活动更快、更强，4-1BB则相对更慢、更温和，但是能延长T细胞寿命并维持其抗癌作用。此外，与目标分子表位位置相适应的不同框架可能可以进一步提高CAR的整体功能。在某些情况下，结合域来自受体配体对，或者可能包含VHH元素而不是scFv。这个体系结构是模块化的，可以适应广泛的目标。

CAR设计继续发展，使用亲和优化的人类结合域，招募不同的信号通路。这种改进的一个例子是将高效的28z CAR设计的激活强度降低，另一个例子是在效率较低的BBz CAR设计中增强了激活强度。其他例子包括：在28z CAR中额外招募JAK/STAT信号；在BBz CAR中添加间隔元件（spacer）以减少细胞因子分泌。

与自然T细胞的单一特异性不同，CAR-T细胞可以通过设计多特异性CARs或CAR共表达来结合多种抗原。针对两种独立的抗原可以减少肿瘤逃逸，增加对肿瘤细胞的选择性压力。首个双靶向CAR-T细胞已经进入临床，它结合了两种靶向CD19和CD22的BBz CARs。结合28z CAR和BBz CAR提供了优越的抗原敏感性和疗效，通过将信号特征与抗原密度匹配进一步增强。

另一种不同的策略——需要两种不同的CARs来成功识别两种上调的肿瘤抗原，以启动完整的免疫细胞功能。Eshhar的团队使用双靶向CAR-T细胞来对抗骨髓瘤细胞，结果表明这是一种有效的CAR-T，而且是一种能保护正常健康组织的安全策略。 

CAR-T细胞治疗实体肿瘤

靶向CD19的CAR-T细胞疗法已获得美国FDA和EMA的批准用于治疗一些难治性白血病和淋巴瘤。将CAR治疗应用于实体肿瘤的治疗仍然是一个主要的目标和挑战。根据对B细胞恶性肿瘤的策略而开展的第一个实体肿瘤试验结果不尽人意，实体肿瘤CAR治疗还需要进一步改进和特殊调整。克服CAR治疗在B细胞恶性肿瘤中遇到的耐药机制可能有助于实现这一目标。

耐药的一个机制是肿瘤细胞中CAR靶点的缺乏或表达不足。来自多个试验的报告显示，接受CD19靶向CAR-T细胞治疗的患者中，多达25%的患者复发，表现为CD19阴性或低CD19。这种现象被称为抗原逃逸。

另一个耐药机制可以追溯到由于物理屏障和/或免疫抑制肿瘤微环境(TME)， CAR-T细胞进入和浸润肿瘤的能力有限。即使有浸润，可以预期实体肿瘤将使用一系列机制来抑制T细胞和CAR-T细胞，包括骨髓源性抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和Treg。因此，CAR-T细胞成功治疗实体肿瘤至少需要确定合适的靶抗原，使CAR - T细胞能够进入肿瘤的所有部位，克服免疫抑制肿瘤微环境(TME)的免疫抑制作用。 

目标选择

第一次对实体肿瘤的尝试复制了在B细胞恶性肿瘤中建立的方法，使用相同的CAR设计(28z或BBz)，并针对单一抗原。虽然偶发性在多形性胶质母细胞瘤(GBM)、头颈部鳞状细胞癌和前列腺癌中获得良好的疗效，但总体疗效不能与CD19 CAR治疗相比较。一个限制是由于缺乏像CD19这样的潜在靶点——CD19主要表达在几乎所有B细胞肿瘤的细胞表面，在部分非关键的正常细胞中表达。很少有分化抗原满足这两个标准，一些在肿瘤中过表达的蛋白虽不是肿瘤特异性的但仍有希望，如间皮素、PSMA、GPC3等。如果CAR-T的作用能够控制在一个特定的治疗窗口内以限制对正常细胞的反应，通过仔细选择scFv、信号成分和转录调节通路，仍有望将一些在正常组织中也表达的肿瘤抗原作为靶标。图2B显示了目前在血液学和实体肿瘤临床研究中CAR靶向抗原的分布情况。

在肿瘤细胞表面经过特异性修饰的细胞表面抗原是一类很有吸引力的CAR靶标。各种聚糖，包括糖脂，N-和O-连接糖蛋白，和糖胺聚糖，可在癌细胞表面特异性糖基化，包括晚期上皮癌中的LewisY，胰腺腺癌中的sialyl-LewisA，神经母细胞瘤和一些胶质瘤中的GD2，以及各种腺癌中的 Tn-MUC1。多糖生物合成中各种酶的参与及其冗余是其稳定表达的原因，因此也靶向它们有助于降低抗原逃逸的风险。肿瘤细胞需要从20多种o-糖基化的GalNAc多肽转移酶中失去一部分酶，才能停止产生Tn抗原。但是，如果蛋白主干发生突变(如Tn-MUC1的MUC1缺失)，仍有可能导致糖蛋白表达缺失。

肿瘤浸润

像任何T细胞一样，CAR-T 细胞需要进入到肿瘤部位并克服肿瘤微环境的免疫抑制才能发挥作用。向外周组织运输的免疫细胞受到复杂的信号转导和物理过程的调节，在某些肿瘤中可能会明显受到干扰。无免疫应答的“冷肿瘤”是所有免疫治疗的共同障碍。

T细胞工程可以设计独特的解决方案。例如，在某些情况下，CAR-T细胞中IL-8受体CXCR2R的过表达，因为趋化因子的靶向迁移，有助于解除肿瘤进入的限制。另一种方法是将CAR-T细胞引导到肿瘤周围。例如，CAR-T细胞可以靶向成纤维细胞相关蛋白(FAP)，它存在于肿瘤微环境的间质成纤维细胞中。针对FAP的CAR-T细胞可以有效浸润实体肿瘤，但也可能具有骨髓毒性。还有一种方法是利用能分泌酶——如表达肝素酶的CAR-T细胞降解硫酸肝素蛋白多糖。

 

图3增强CAR-T细胞治疗实体瘤疗效的新策略:

(A) car修饰的T细胞表达趋化因子受体，以增加其运输/返回肿瘤位点的能力(如CXCR2)。

(B) fap特异性CAR-T细胞可以引导CAR-T细胞围绕肿瘤。

(C)肝素酶的表达增强了CAR-T细胞在TME中的通路。

(D)实体肿瘤中CAR - T细胞的瘤内给药。

(E)与靶向免疫检查点抑制受体的单克隆抗体联合治疗，缓解免疫抑制。

(F)降低受体功能或耗尽标记的siRNA。

(G)工程CAR-T细胞可分泌促炎或支持CAR-T的细胞因子，如IL-2、IL-7、IL-12或IL-15。

(H)提出整合多种代谢策略(如l-精氨酸)，优化CAR - T细胞的制备工艺，使其治疗效果最大化。

 

在实体肿瘤中，局部或局部CAR-T细胞输送不仅可以最大限度地增加CAR T细胞在肿瘤部位的聚集，而且通过限制其在全身的分布来提高其安全性。针对间皮瘤间皮素的局部CAR治疗显示了有效和持久的CD4依赖的肿瘤免疫，与静脉给药相比可以提供更大的抗肿瘤疗效。 

微环境免疫抑制

肿瘤及其基质能吸引和支持多种免疫抑制细胞——包括骨髓源性抑制细胞、巨噬细胞、Foxp3+ Treg、成纤维细胞和血小板。人们正在研究各种作用于肿瘤微环境相关免疫抑制的抑制剂。通过将这些药物与CAR-T细胞结合来克服肿瘤微环境可能是有用的。通过阻断抑制性免疫检查点来阻断强制性免疫抑制是一个很有前景的选择。

可以通过将CAR-T细胞与免疫检查点抑制抗体结合使用来抑制检查点，或在细胞中降低其功能或减少主要受体来实现。

干扰RNA提供了另一种减少但不能完全消除受体功能的方法，例如沉默腺苷受体和其他耗尽标志物，如TIM-3、LAG-3、TIGIT和KLGR-1。

腺苷酸介导的T细胞抑制可以其他手段抵消：比如使用shRNA，或通过融合腺苷受体的细胞外结构域和腺苷的细胞内共刺激结构域来响应CAR A2AR基因靶标，以这种方式将通常的抑制信号是转化为一个激活的信号。

CAR-T细胞可以用来改变肿瘤微环境。例如，CAR-T细胞可以提供局部细胞因子的分泌，增强其浸润、增殖和持久性。CAR-T细胞可以被设计成产生多种细胞因子(如IL-4、IL-2、IL-7、IL-21和IL-15)或它们的同源受体，目的是提高这些细胞的抗肿瘤活性和持久性。

这些CAR-T细胞有时被称为装甲CAR、第四代CAR或TRUCK(重定向T细胞用于不受抗原限制的细胞因子启动的杀伤)。例如，TRUCK已被证明：通过诱导或组成表达IL-12，可激活固有免疫抗肿瘤反应，改变肿瘤免疫抑制。 

癌细胞糖酵解代谢的增强可能会限制肿瘤中的CAR-T细胞可获得的营养物质，阻碍其功能或生存，从而影响微环境，抑制免疫细胞。已有研究表明，使用预处理体外给养或用肿瘤抑制的特定代谢途径可为CAR-T提供营养物质，例如在过代移植前为CAR-T细胞提供l-精氨酸，可以提高CAR - T的存活率。

  

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CAR - T细胞治疗的毒性

CAR-T细胞是强大的免疫效应剂，在某些情况下可能导致严重的毒性，需要专家和紧急医疗管理。对于任何特定的患者，这些急性毒性的发生仍然难以预测，阻碍了CAR治疗的广泛开展。

第一种毒性是预料之中的，由于CD19是未成熟B细胞特有，CAR-T细胞靶向非肿瘤B细胞会导致B细胞发育不全。人们提出了不同的方法来抑制其对正常细胞的毒性。具有分离的共刺激结构的第二代CAR，结合传统的激活结构和抑制型CAR，通过确保效应细胞只有在存在某种肿瘤相关抗原阵列时才完全激活，能够达到更高水平的目标准确性。

通过在RNA转染后能瞬时表达CAR结构的T细胞，可以限制未知的CAR-T细胞毒性，从而最大限度地缩短不可预见的毒性持续时间。在实体肿瘤的背景下，转基因T细胞的局部输送也可以降低毒性，同时提高疗效。

另一种减少副作用的方法是找到最小的有效剂量。Globerson Levin等人模拟了达到治疗效果所需的CAR-T细胞数量，减少注射的CAR-T细胞数量的同时减少副作用。这也显示了使用比目前标准更少的CAR-T淋巴细胞的可能性。

另外两种毒性——细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性带来了目前为止更大的挑战。在第一次CD19 CAR试验开始时没有预料到会出现这些问题。这两种毒性均发生在CAR-T细胞给药后的早期，在多达三分之一的接受CAR-T细胞的患者中发生。

CRS机制已开始得到较好的解释。病理细胞因子的分泌主要归因于肿瘤微环境中CAR-T细胞与骨髓细胞的相互作用。虽然活化的T细胞产生趋化因子和细胞因子，包括IL-2、可溶性IL-2R-α、IFN-γ、IL-6、可溶性IL-6R和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，IL6 IL1和IL1的主要来源是肿瘤附近的巨噬细胞和CAR-T细胞。CRS治疗的基础是IL6R阻滞剂和皮质类固醇，但新的干预措施，包括IL1Ra和达沙替尼越来越受关注。人们对神经毒性知之甚少，目前主要用皮质类固醇治疗。通过自杀基因或其他表达开关，通过可逆地关闭CAR-T信号转导或不可逆地消除CAR-T细胞来终止CAR-T细胞的活性。自杀基因可以包含在转染结构中，在特定药物诱导后触发细胞凋亡。

因此，虽然急性CAR- T细胞毒性目前限制了CAR-T细胞的广泛应用，但考虑到CAR设计的快速发展和我们对CRS病理生理学的理解，可以预期这一限制最终将被消除。

CD19 CAR-T疗法为细胞免疫治疗和合成免疫打开了大门。这些进展将取决于受体和通路设计、肿瘤免疫学、基因工程和细胞制备的进展。CD19 CAR - T细胞在过去10年取得的临床结果有了飞跃的进步，促使更多制药行业加快探索和投资基于细胞的免疫疗法。开发一系列个性化治疗需要大量的工作，需要确定合适的靶点，克服肿瘤微环境的免疫抑制，进入“冷肿瘤”，并最大限度地减少毒性和对正常细胞的影响。 

(来源:互联网,仅参考)

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