免疫检查点蛋白的分析和鉴定，其实并不易

免疫检查点（immune checkpoint）分子在免疫反应发生的过程中调节免疫系统T细胞与抗原之间的相互作用。这些可以是共刺激作用，也可以是共抑制作用。共刺激分子包括CD28、ICOS和CD137等，共抑制分子则包括PD-1、CTLA-4 和 VISTA等。

这些分子在迷宫一般的分子通路中发挥作用，并且有望应用于癌症的精准治疗，这就需要良好的分析方法。在研究免疫检查点蛋白及其互作分子时，尽管液相色谱-质谱（LC-MS）方法已经取代了蛋白质组学中的生化分析，但临床应用需要更高的稳定性和可靠性。

主要参与者

CD28的连接，再加上T细胞受体（TCR）的激活，启动了免疫反应。这两者都是必需的，因为尽管TCR激活能够很好地区分“自我”和“非自我”，但它还需要强烈的CD28信号来区分致病抗原和良性抗原。

ICOS（可诱导T细胞共刺激分子）是一种在活化T细胞上表达的表面标志物，可与抗原呈递细胞上的特定配体结合。ICOS抗体与肿瘤浸润T细胞的结合刺激了ICOS阳性T细胞扩增，并增强了T淋巴细胞存活及其肿瘤细胞反应。JTX-2011 和 GSK3359609 等 ICOS 单克隆抗体目前正处于开发阶段。

检查点调节分子 CD137（又称为 4-1BB）在自然杀伤（NK）细胞和T细胞上均有表达，因此它可以诱导先天免疫和适应性免疫。免疫细胞暴露于肿瘤抗原后，CD137 会刺激 T 细胞和 NK 细胞扩增并共同提高它们的抗肿瘤活性。由于其在炎症中的作用及其在血管中的表达，CD137 与动脉粥样硬化斑块的形成有关，而这种斑块是心脏病发作和中风的前兆。

相比之下，免疫检查点的共抑制分子PD-1、CTLA-4 和 VISTA 则抑制免疫反应，保护健康组织不受靶向和破坏。然而，这个过程往往被肿瘤细胞所劫持。肿瘤细胞常常会上调 PD-L1等分子，使其抑制抗肿瘤 T 细胞反应并逃避免疫系统的攻击。

VISTA是T细胞的抑制性检查点蛋白，主要在造血细胞上表达，在人髓样细胞、CD4+ T 细胞和 FoxP3+ 调节性 T 细胞上的表达量最高。作为共抑制配体，VISTA通过与 T 细胞上表达的未知受体相互作用来直接抑制 T 细胞功能。

PD-1（程序性细胞死亡蛋白1）和CTLA-4（细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4）是目前研究最多的免疫检查点蛋白，也是几种突破性药物的靶点。

PD-1与两个配体结合：PD-L1和PD-L2。PD-L1 占主导地位，并在造血细胞（包括 T 细胞、B 细胞、树突细胞、巨噬细胞和肥大细胞）以及其他许多细胞（包括内皮细胞和上皮细胞）和多个肿瘤上表达。PD-L1的上调能够抑制T 细胞的抗肿瘤免疫反应，使肿瘤逃避免疫系统的攻击。

CTLA-4和CD28是T细胞表达的受体，与B7家族的蛋白 B7-1/CD80 和 B7-2/CD86 结合。CD28 在初始 T 细胞上呈组成型表达，并在与这些配体结合后提供共刺激信号，而 CTLA-4 在 T 细胞活化后上调，并在与这些配体结合后传递共抑制信号。

尽管PD-1和CTLA-4占主导地位，但它们并不是唯一的检查点蛋白，也不是唯一重要的蛋白。许多正在评估的新药以几种免疫检查点蛋白为靶点，包括LAG3、TIM3 (HAVCR2)、CD40和GITR (TNFRSF18)。一些临床试验也在研究pembrolizumab以及LAG3、RORC、CTLA-4抗体或JAK1、EGFR、MEK1/2小分子抑制剂的联合治疗效果。

免疫检查点抑制剂的鉴定

基于液相色谱的方法，尤其是质谱法，目前正广泛应用于蛋白质组学中。不过随着更多的检查点抑制剂药物进入临床试验并最终获得批准，分析范围将大大扩大。临床分析将不仅限于主要参与者，可能还需要监测次要参与者，如化学信号、蛋白质组副产物或代谢物，以及上调或下调的免疫细胞群。

对于药物开发人员和监管机构而言，信息当然越多越好。分析内容以及方法的重复性和稳定性，会影响开发和批准策略，并最终决定治疗的效果。

欧洲的研究人员认为：“选择最准确的统计方法、终点和临床试验来估计免疫检查点抑制剂的益处仍是一个未解决的方法学问题。考虑到非常规的应答或进展模式，新型应答评估工具在临床试验中的应用是一种未满足的临床需求。”

例如，定量检查点抑制剂nivolumab水平的LC-MS方法可以用来评估接受nivolumab治疗的非小细胞肺癌患者的血浆样本。一项研究表明，在5-200 μg/ml的浓度范围内，临床方法与非临床方法取得合理的一致（15%以内）。

然而，在临床环境中，研究人员可能不仅仅是分析检查点抑制剂水平，或是寻找低于标准方法提供的检测限。nivolumab 疗效的另一面是药物的副作用，针对多个器官系统。预测哪些患者会经历这些不良事件，可能需要基于时间的比较，即药代动力学分析。

获得精确的数字，包括有临床意义的浓度变化，需要更精细的方法（包括内标、浓度曲线、残留和应答比计算）来校正样本和方法的可变性。这些研究需要完整的蛋白质或易于鉴定的替代物或蛋白水解产物。幸运的是，nivolumab的Fab 区域从替代物的角度来看是符合要求的，并且也可以通过标准的蛋白水解方法获得。

结语

这篇文章只是想指出几点：

▪ 检查点抑制很复杂，可能涉及到多条通路和尚未发现的靶点
▪ 虽然单个检查点蛋白和抑制剂的活性有很大差异，但它们都由氨基酸组成，因此很容易通过传统的蛋白质组学LC-MS来分析
▪ 未来的检查点抑制剂分析将适应当今的分析模式——蛋白质组学 LC-MS，但要真正实现诊断还需要广泛的验证和调整
▪ 机会存在于蛋白质组学分析之外，尤其是在代谢组学中，有望发现检查点蛋白或抑制剂以及治疗效果的替代标志物