生命科学学院徐冬一组揭示范可尼贫血症发病新机制

　　

范可尼贫血症（Fanconi anemia, FA）是一种严重的人类遗传疾病，最初由瑞士儿科医生Guido Fanconi在1927年发现记录(1)。其主要表现为骨髓衰竭（bone marrow failure，BMF）、发育畸形及癌症的易发性。迄今为止，已发现至少有22种FA基因（FANCA-W）的突变将会导致该疾病的发生。这些基因表达的蛋白共同参与一条特殊的DNA修复途径——范可尼修复途径（FA pathway）。由于FA患者的细胞对引发DNA链间交联（interstrand crosslink， ICL）的药物表现出超高的敏感性。因此，长期以来人们普遍认为FA途径的主要功能是修复ICL，而FA疾病是由内源性ICL的修复缺陷引起的。然而，产生ICL的内源性诱导因素仍然难以捉摸。最近的小鼠和人类遗传证据表明，内源性的醛类是FA病症的原因(2, 3)。但醛类不仅能够引起ICLs，更多的是产生单加成物(4)、引起蛋白质-DNA的交联(5)，还能通过影响四氢叶酸的代谢产生复制压力(6)。因此，依然无法确定哪种DNA损伤修复的缺陷最终导致FA疾病。

2021年6月10日，北京大学生命科学院、蛋白质与植物基因研究国家重点实验室徐冬一课题组在Nature Structural & Molecular Biology上发表文章“Fanconi anemia proteins participate in a break-induced-replication-like pathway to counter replication stress”，发现FA途径本质上是一条断裂诱导的复制（break-induced replication，BIR）途径，用于修复停滞的复制叉，并且提出了持续复制压力是FA症状的潜在内源性病因的观点。

染色体DNA在生命的延续过程中处于核心地位，因此DNA的精准复制以及基因组的稳定维护具有特别重大的意义。然而，来自于内源以及外源的各种扰动会干扰复制过程的正常进行与完成，形成复制压力（replication stress）。复制压力会导致复制叉前进减缓甚至停止，影响DNA的合成。持续的复制压力会导致复制叉崩塌，从而造成双链断裂，该损伤对细胞以及生命体伤害巨大而且难以修复。复制压力造成的复制叉停滞也是癌细胞基因组重排和突变的主要来源。因此损伤复制叉的修复和重启对生命体具有重要的意义。

尽管FA蛋白已被证明可能参与复制压力应答，但与之相悖的是长期以来人们从未发现FA缺失细胞对复制压力药物的敏感性(7-9)。该研究作者首先验证了这一结论，发现FA基因缺失型细胞对短期处理的复制压力药物aphidicolin（APH）或hydroxyurea（HU）并不敏感。令人惊讶的是，FA缺失细胞系对持续复制压力药物（APH或HU）处理表现出极高的敏感性。这种敏感性来自于持续复制压力下，FA缺失细胞染色体的逐渐丢失。进一步的免疫荧光实验发现FA细胞在分裂后期产生的超细DNA桥结构（UFBs）以及微核均有明显的增加。

该研究实验组在早期的研究(10)中发现，停滞的复制叉通过两个主要途径完成重启过程：在复制压力的早期依赖53BP1 的切割非依赖途径，以及在复制压力晚期依赖BRCA1 （也称为FANCS，该基因突变也引起FA疾病）的断裂诱导复制（BIR）途径。53BP1 和BRCA1 在复制压力下拮抗性地调节了两条停滞复制叉重启途径的选择。BIR 是一种独特的同源重组（homologous recombination，HR）机制，用于修复单端的DNA 断裂。该途径也参与分裂期DNA合成过程（Mitotic DNA Synthesis， MiDAS过程），它的缺失会导致UFB和微核。该研究作者证明了FA蛋白在BRCA1依赖的BIR/MiDAS途径中发挥着重要作用，FA蛋白作用于BRCA1的下游、促进复制叉切割，从而协助停滞的复制叉重新启动。在进一步研究中发现BIR途径和FA途径具有统一的分子机制：首先，53BP1-BRCA1拮抗性地调节FA途径的起始步骤——复制叉切割，这种拮抗能力源自于它们在复制叉重启中的功能；其次BIR途径和FA途径均是依赖核酸酶SLX4和FAN1来介导复制叉的切割过程；最后，它们均依赖于POLD3来完成DNA的合成过程。这表明FA途径本质上是一种BIR途径。

FA蛋白参与复制重启的模式图

基于FA蛋白在复制压力下的BIR途径中的重要作用，本研究作者推测复制压力可能是造成FA症状的内源性因素。为了验证此猜想，本研究作者构建了FANCL缺失的小鼠模型，通过每日腹腔注射低剂量的复制压力药物HU后，发现持续复制压力能够引发FANCL缺失小鼠的贫血症状，其小鼠造血祖细胞的增殖分化功能异常，最终触发FANCL缺失小鼠的骨髓衰竭表型。在寻找FA病症与复制压力相关的生理条件下的证据时，本研究作者发现复制压力能够特异性诱导FANCC缺失的人淋巴TK6细胞7号染色体的丢失，这一现象与已经发现的FA病人细胞频发的7号染色体丢失相一致，进一步说明持续复制压力是FA症状的潜在的内源性病因。

对照组与实验组小鼠股骨HE染色切片（a）和单位面积骨髓内的细胞量统计（b）

该研究揭示了FA途径本质的功能和分子机制、阐释了范可尼病症发病的新机制。这不仅能够帮助大家预防和治疗FA基因突变导致的骨髓衰竭等症状，还将有助于正常人群预防和治疗血液系统早衰，同时加深大家对癌症发生发展的理解，具有重要理论和临床意义。

北京大学生命科学院徐冬一组许鑫璘博士、徐毅曦博士后为该研究论文的共同第一作者。此外，该组的郭瑞媛、续然和付聪聪等同学也在该研究中作出了贡献。同时该研究得到了北京大学生命科学学院李晴课题组、京都大学生命科学研究科放射生物学研究中心Minoru Takata课题组和京都大学医学研究科辐射遗传学系Shunichi Takeda课题组的支持与帮助。

参考文献：

1. Bogliolo M, Surrallés J. Fanconi anemia: a model disease for studies on human genetics and advanced therapeutics. Current opinion in genetics & development. 2015 2015/08/01/;33:32-40. doi:https://doi.org/10.1016/j.gde.2015.07.002.

2. Langevin F, Crossan GP, Rosado IV, Arends MJ, Patel KJ. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 2011 Jul 6;475(7354):53-8. eng. Epub 2011/07/08. doi:10.1038/nature10192. Cited in: Pubmed; PMID 21734703.

3. Hira A, Yabe H, Yoshida K, Okuno Y, Shiraishi Y, Chiba K, Tanaka H, Miyano S, Nakamura J, Kojima S, Ogawa S, Matsuo K, Takata M, Yabe M. Variant ALDH2 is associated with accelerated progression of bone marrow failure in Japanese Fanconi anemia patients. Blood. 2013 2013/10/31/;122(18):3206-3209. doi:https://doi.org/10.1182/blood-2013-06-507962.

4. Duxin JP, Walter JC. What is the DNA repair defect underlying Fanconi anemia? Current Opinion in Cell Biology. 2015 2015/12/01/;37:49-60. doi:https://doi.org/10.1016/j.ceb.2015.09.002.

5. Cohen Hubal EA, Schlosser PM, Conolly RB, Kimbell JS. Comparison of Inhaled Formaldehyde Dosimetry Predictions with DNA–Protein Cross-Link Measurements in the Rat Nasal Passages. Toxicology and Applied Pharmacology. 1997 1997/03/01/;143(1):47-55. doi:https://doi.org/10.1006/taap.1996.8076.

6. Garcia-Calderon CB, Bejarano-Garcia JA, Tinoco-Gago I, Castro MJ, Moreno-Gordillo P, Piruat JI, Caballero-Velazquez T, Perez-Simon JA, Rosado IV. Genotoxicity of tetrahydrofolic acid to hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Death Differ. 2018 Nov;25(11):1967-1979. Epub 2018/03/08. doi:10.1038/s41418-018-0089-4. Cited in: Pubmed; PMID 29511342.

7. Schlacher K, Wu H, Jasin M. A distinct replication fork protection pathway connects Fanconi anemia tumor suppressors to RAD51-BRCA1/2. Cancer cell. 2012 Jul 10;22(1):106-16. eng. Epub 2012/07/14. doi:10.1016/j.ccr.2012.05.015. Cited in: Pubmed; PMID 22789542.

8. Tian Y, Shen X, Wang R, Klages-Mundt NL, Lynn EJ, Martin SK, Ye Y, Gao M, Chen J, Schlacher K, Li L. Constitutive role of the Fanconi anemia D2 gene in the replication stress response. The Journal of biological chemistry. 2017 Dec 8;292(49):20184-20195. eng. Epub 2017/10/13. doi:10.1074/jbc.M117.814780. Cited in: Pubmed; PMID 29021208.

9. Chen X, Bosques L, Sung P, Kupfer GM. A novel role for non-ubiquitinated FANCD2 in response to hydroxyurea-induced DNA damage. Oncogene. 2016 Jan 7;35(1):22-34. eng. Epub 2015/04/22. doi:10.1038/onc.2015.68. Cited in: Pubmed; PMID 25893307.

10. Xu Y, Ning S, Wei Z, Xu R, Xu X, Xing M, Guo R, Xu D. 53BP1 and BRCA1 control pathway choice for stalled replication restart. eLife. 2017;6. doi:10.7554/eLife.30523.