抗生素抗性基因研究与高通量qPCR技术

　　

发现和使用抗生素，是二十世纪医疗领域两大重要突破。抗生素的使用显著降低了人类发病率和死亡率。同时，抗生素与其他抗菌剂在农业领域也有广泛应用，如畜牧业，水产养殖等。

抗生素可以破坏细菌细胞壁、阻碍DNA、RNA或蛋白质的合成，抑制细菌的代谢生长。面对抗生素，细菌也有应对的办法，如阻止抗生素渗透细胞壁、表达出外排系统加速抗生素排除到细胞外^[1-3]。此外，研究也发现，细菌可以通过接合、转导、或转化等途径吸收外源DNA，获得抗生素抗性基因（ARGs）^{[4, 5]}。在此基础上，进一步的研究发现移动遗传元件（MGE），如质粒、转座元件、整合子等，在细菌抗性基因转移中发挥着重要作用^{[6, 7]}。这些遗传元件所编码出的酶，其主要功能包括对抗生素修饰或使其失活、组成外排系统、对催化位点的修饰等^[8]。在这些功能作用下，进一步加快了细菌获得抗生素抗性。

这些抗生素抗性基因一旦进入到与人类相关的病原体系统中，将会对人们的生活造成严重影响，如多抗性细菌病原体导致的院感问题。多项研究显示，抗生素抗性基因在各种不同的生态系统中是广泛存在，从土壤、水体、人类肠道，到一些极端环境中，如永久冻土，都有它的身影^[9]。抗生素抗性基因的影响受到了越来越多的关注，对其进行追踪监测也变得十分必要^[10]。目前已有上千种抗生素抗性基因得到鉴定，可以赋予细菌对上百种抗生素产生抗性。传统的qPCR方法无法轻松高效地应对如此大规模的研究。高通量技术为抗生素抗性基因研究带来了极大的便利，应用在抗生素抗性基因研究中的高通量技术包括微阵列杂交芯片、宏基因组测序，以及高通量qPCR^[11]。

微阵列杂交芯片在检测通量方面具备优势。在一张芯片上可以对上千个抗性基因进行分析。但微阵列杂交芯片在实际的应用中会受到批间差的影响，检测的灵敏度和特异性相对较低。所获得的数据往往还需要额外的qPCR实验对其进行二次验证^{[12, 13]}。宏基因组测序同样具备高通量的优势，并且可以实现对未知序列的分析。但作为一种测序技术，宏基因组测序同样需要一系列文库构建过程，以满足测序设备所需要的起始量要求。对测序结果的解析可能需要复杂的生物信息学工具，整体要求较高。

与前两种技术相同，高通量qPCR技术同样可以满足抗生素抗性基因研究的通量要求。此外，高通量qPCR技术对样本质量要求相对友好，可以执行纳升体系的检测反应，所需样本量和试剂耗材较少。Waseem等人^[11]通过荟萃分析对截至2018年10月发表过的抗生素抗性和高通量qPCR相关文献进行了研究。在最终筛选得到51篇发表文献中，38篇通过SmartChip Real Time PCR System完成。

SmartChip系统作为高通量qPCR平台的代表之一，通过自动化微量液体操作和微孔芯片技术结合的方式，在一次实验中即可完成上千个定量PCR反应。凭借灵活的操作方式，在抗生素抗性基因研究领域发挥了强大的作用。

SmartChip系统荧光定量PCR实验流程示意图

MyDesign芯片是SmartChip系统重要的耗材之一。MyDesign芯片表面按72×72的方式排布了5,184个纳升体积微孔，可进行100 nl体系的定量PCR反应。

MyDesign芯片

目前，SmartChip系统检测过抗生素抗性相关基因384种，涉及土壤、水源、沉淀（沉积）物、粪便、污泥等多种样品类型。与高通量测序技术一起，成为抗生素抗性基因研究领域第一梯队的重要成员。

表一 SmartChip系统检测过的抗生素抗性相关基因

抗生素抗性相关基因	检测引物数量
Tetracycline（四环素）	30
Trimethoprim（甲氧苄啶）	19
Vancomycin（万古霉素）	22
Aminoglycoside（氨基糖苷类抗生素）	60
Amphenicol（酰胺醇类抗生素）	19
Beta-lactamase（β-内酰胺酶）	56
Fluoroquinolone（氟喹诺酮）	11
Sulfonamide（磺酰胺）	7
Mobile genetic elements（移动遗传元件）	52
Multidrug resistance（多重耐药性）	48

数据来自Takara Bio USA, Inc.网站

抗生素抗性基因研究与人类健康息息相关。SmartChip Real Time PCR System将凭借其灵活自由、高通量的优势助力科研人员取得更多研究发现！

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【参考文献】
[1] Davies J, Inactivation of antibiotics and the dissemination of resistance genes. Science 264: 375-382 (1994)
[2] Rybak M J, Resistance to antimicrobial agents: an update. Pharmacotherapy 24: 203S-215S (2004)
[3] Sheldon A T Jr, Antibiotic resistance: a survival strategy. Clin Lab Sci 18: 170-180 (2005)
[4] Davison J. Genetic exchange between bacteria in the environment. Plasmid 42: 73-91 (1999)
[5] Thomas C M, Nielsen K M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nat Rev Microbiol 3: 711-721 (2005)
[6] Toussaint A, Merlin C. Mobile elements as a combination of functional modules. Plasmid 47: 26-35 (2002)
[7] Frost L S et al. Mobile genetic elements: the agents of open source evolution. Nat Rev Microbiol 3: 722-732 (2005)
[8] Mazel D, Davies J. Antibiotic resistance in microbes. Cell Mol Life Sci 56: 742-754 (1999)
[9] Martínez J L et al. What is a resistance gene? Ranking risk in resistomes. Nat Rev Microbiol 13: 116-123 (2015)
[10] World Health Organization. Antimicrobial Resistance: Global Report on Surveillance. (2014)
[11] Waseem H, et al. Contributions and challenges of high troughput qPCR for determining antimicrobial resistance in the environment: A critical review. Molecules 24: 163 (2019)
[12] Jeanty C, et al. An optimized protocol for microarray validation by quantitative PCR using amplified amino allyl labeled RNA. BMC Genomics 11: 542 (2010)
[13] Morey J S, et al. Microarray validation: Factors influencing correlation between oligonucleotide microarrays and real-time PCR. Bio Proced Online 8: 175-193 (2006)

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