顾宏周团队开发利用环化酶高效制备DNA单环和拓扑结构的新技术

　　

 环状单链脱氧核糖核酸（circular ssDNA）在分子生物和DNA纳米技术等领域扮演着重要的角色，如作为滚环扩增的必备模板、DNA拓扑结构的构成单元等。目前常用的依赖于T4 DNA连接酶制备环状单链DNA的方法容易产生多聚体副产物，导致单体环产率低；而现有的基于CircLigase（一种单链环化酶）制备环状单链DNA的方法虽然可一定程度上减少副产物，但是随着底物DNA链长度的增大，CircLigase催化成环的效率急剧下降。因此，高效率地制备单链环形DNA仍是一个亟待解决的问题。

 2020年12月31日，我院顾宏周团队在Analytical Chemistry杂志发表了题为“Programming CircLigase Catalysis for DNA Rings and Topologies”的论文，报道了一种基于CircLigase高效制备DNA单环和拓扑结构的新技术。这一技术主要通过在单链DNA末端设计杂交的结构使得CircLigase参与的酶促反应由不可控的熵变主导转为可控的焓变主导，从而高效率（>75%产率）无副产物地合成DNA单环。该技术不仅将CircLigase的催化DNA成环产率稳定地提升至75%以上，而且突破了CircLigase对于可环化的DNA片段的长度的限制，在几百碱基的长链DNA上都得到了验证。课题组同时利用CircLigase预制备的单链DNA环作为起始组装材料获得了高纯度的DNA拓扑嵌套结构。

 文章中首先确定了末端杂交结构对高效成环的必要性，测试了一系列参数：如反应温度、末端互补配对碱基数、末端不配对碱基个数和末端碱基种类等对成环效率的影响，并建立了可以被CircLigase催化高效成环的单链DNA模型。文章中还进一步地研究确定了对于较长（例如200至500个碱基）单链DNA底物链，末端杂交结构同样能帮助其高效成环。

 此外，该团队进一步研究发现末端杂交结构可以从DNA分子内转移至DNA分子间，即末端杂交结构也可提高两条不同单链DNA分子间的连接效率。并且末端杂交结构可以由单链DNA底物自身互补配对提供，也可以通过一条辅助DNA链与单链DNA底物末端配对形成，两种杂交方式连接效率相当。随后，又提出末端结构通过拉近单链DNA底物5’和 3’端距离，从而提高CircLigase催化成环效率的猜想。

 综上，该团队提出了一种简单有效的在单链DNA末端设计杂交结构的策略提升CircLigase催化DNA成环的效率，而高产率和高纯度制备环状DNA不仅在纳米技术方面有潜在应用，也可用来筛选更加稳定的作为肿瘤诊断和治疗的新一代核酸适配体。值得一提的是，CircLigase本身在病毒中作为一种RNA连接酶。由于DNA与RNA化学结构相似，因此该研究中设计末端杂交结构提高CircLigase环化DNA效率的策略理论上也适用于RNA底物。利用这套策略原则上也可以稳定高效地合成天然存在的环状RNA分子，以便在体外研究其结构和功能。

 复旦大学生物医学研究院研究生李青婷为第一作者，顾宏周研究员为通讯作者。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.0c04668