研究背景
- 作为细胞的重要组成成分，蛋白质是由不同氨基酸按照一定的顺序排列形成的，氨基酸顺序不同会导致蛋白质的空间结构不同，结构决定功能，从而形成成千上万种具有不同功能的蛋白质，满足正常的生命活动。
- 其次，某种蛋白质氨基酸序列改变——即使是单个氨基酸的突变或者修饰——会使蛋白质的功能发生改变，进而影响正常的生命活动，像大多数癌症都是由于基因突变导致蛋白质氨基酸改变而引起的。
- 最后，某些蛋白质也可以作为药物和生物标志物，作为疾病早期检测的指标。
综上可知蛋白质序列的研究对于预测蛋白质结构，疾病的检测和蛋白质类药物的开发具有重要意义。
目前能够用于的蛋白质测序方法有质谱测序和 Edman 降解法。质谱法和 Edman 降解法操作过程复杂、样品需求量大、纯度要求高、耗时较长、通量低，且 Edman 降解法不能检测 N 端氨基被封闭的样品，且仅仅只能检测 50 个氨基酸长度的多肽。
然而，蛋白质在生物体中都是以混合物的形式存在，而生物体内也存在稀有的蛋白质突变；另一方面，前蛋白质还没有像 DNA 和 RNA 那样可以通过 PCR 方法实现扩增的技术。鉴于此，对于这些稀有蛋白质因浓度过低和纯度较差而不能用目前的蛋白质测序技术进行测序，急需一种高通量、低成本、样品需求少、操作简单的蛋白质测序技术。
论文概述
本文巧妙利用解旋酶控制 DNA 的运动，进而控制其所链接的多肽按照氨基酸线性顺序通过一个纳米孔道，进而得以通过电信号的变化检出其氨基酸序列。
这种检测技术实现了 17 个氨基酸长度多肽检测，在中性多肽骨架中，虽然没有实现单氨基酸的精确分辨，但是可以非常明显的区分带负电的氨基酸，例如天门冬氨酸，谷氨酸和磷酸化的丝氨酸。同时也发现了多肽测序中不同电荷对多肽运动的影响。此外，本文发现解旋酶 (helicase) 的双聚体可以实现对同一多肽的反复测序，这为进一步提高多肽测序的准确率奠定了基础。
图1. 文章作者巧妙利用解旋酶控制 DNA 的运动进而控制其所链接的多肽按照氨基酸线性顺序通过 MspA 纳米孔。该方法的重点在于使用一个适合回溯测序的 DNA 动力蛋白，例如本文所使用的 MTA 解旋酶，以及一个检测区 (constriction) 在蛋白通道底部的纳米孔蛋白，例如 MspA-M2 纳米孔。
由于 MspA 的检测区到顶端的距离较长，因此为了检测更长的多肽，该文作者们选择 MspA-M2 作为检测时所用的纳米孔。他们合成了不同长度的多肽，在多肽一端加上 ssDNA，另一端添加上 ployT；当 polyT 的信号被检测到时即证明多肽已被检测完全。
经过数据统计发现，当达到 17aa 时 polyT 信号的出现概率还在 50% 以上，但对于 18aa 和 19aa 而言 polyT 信号已几乎检测不到。如此可以认为该方法可检测的多肽长度为 17aa。
为了进一步增加测序的长度，作者们将 MTA 解旋酶 (MTA-h) 融合表达。虽然结果显示检测的长度并未增加，但可以发现对于同一多肽链可以多次读取。可能的原因是，在双酶系统中，当多肽到达下方的 MTA-h 时，下方的 MTA-h 远离 MspA-M2 顶端，使得上方的 MTA-h 瞬间下降，而由于上方的 MTA-h 仍然结合在 ssDNA 上，因此可以再次使多肽链匀速地通过 MspA-M2 的检测区，从而实现了多次检测。该种测序方法对于提高测序的准确度具有十分重要的意义。
作者们在该多肽链的 5 和 9 号位分别进行了单突变构建及磷酸化修饰，同时在 5、6 位点进行了双突变；当 5 号为突变成酸性氨基酸，或被磷酸化修饰后，电流波形图上均会产生一个小驼峰（相较于氨基酸突变及非磷酸化的情况）；当 9 号为突变成酸性氨基酸并发生磷酸化修饰后，也会产生较 5 号位后移的一个小驼峰；当 5、6 号位双突变成酸性氨基酸时，小驼峰的信号会进一步增强。
几乎所有的中性或者带有酸性氨基酸残基的多肽信号中都普遍出现了位于“DNA-多肽”信号转换区的大量毛刺型电流振荡，而碱性氨基酸 K 或 R 的突变却未发生明显的代表电流振荡的毛刺现象。其中的原因可能是 DNA-多肽转换区中存在着一个从强负电荷到中性或者弱电荷的转换。在这一过程中，原先的 DNA 在电场中受到的拉伸作用有可能被迅速地释放，从而形成类似于弹簧松弛的振荡。另一方面，K 或 R 的正电荷在电场中产生了一个对于多肽向上的推力，使得这一转化过程缩短或者抑制了振荡。
小结
与最近发表在 Nano Letter 和 Science 上的两篇论文类似，本文也展示了通过 DNA 马达控制“DNA-解旋酶”穿过 MspA 纳米孔的工作，进而获得与序列相关的电流信号。不同的是，本文选择了非带电的多肽骨架，因此发现了与前文截然不同的信号模式。
当不带电或所带电荷较少的多肽链通过纳米孔时，其过孔电流信号并不像 DNA 和 RNA 那样具有明显的电流台阶信息（其原因有可能是这类多肽骨架在 MspA-M2 的检测区并不以被拉伸的状态存在），所产生的电流可能是多个氨基酸的贡献；这类多肽骨架上的负电荷突变（比如 D、E 以及磷酸化可以产生的增强电流）可能也与电场对多肽的局部拉伸有关。
本文还观测到了非常有趣的振荡电流现象；当存在带正电荷的氨基酸残基时，这类振荡电流会消失，也从侧面说明了电荷对多肽运动行为的重要影响。因此，本文进行了非常系统的可控多肽过孔研究，与此前的两篇文献进行印证，证明了多肽在检测区拉伸的重要性。
在将来，为了能成功区分出不同的氨基酸，一方面可以改善纳米孔的分辨率，另一方面可以利用电渗流的方法将多肽链拉伸，这些改进将为低成本单分子肽测序技术的开发铺平道路，在科学发现和临床应用方面拥有巨大的潜力。
论文信息
Controlled movement of ssDNA conjugated peptide through Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) nanopore by a helicase motor for peptide sequencing applicationZhijie Chen, Zhenqin Wang, Yang Xu, Xiaochun Zhang, Boxue Tian and Jingwei Bai*（白净卫，清华大学）
Chem. Sci., 2021
http://doi.org/10.1039/D1SC04342K
原文链接：https://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2021/SC/D1SC04342K
