Science：利用纳米孔实现单氨基酸分辨率的蛋白质测序

最近，荷兰代尔夫特理工大学和美国伊利诺伊大学香槟分校的研究人员扩展了纳米孔测序的应用范围，提供了蛋白质测序的概念验证。他们证明，采用纳米孔能够以单个氨基酸的分辨率对蛋白质进行鉴定，且误差极小。

　　

DNA序列当然可以提供蛋白质的相关信息，但并不能提供完整信息，比如蛋白质丰度和翻译后修饰。因此，若有一种方法能够在单分子水平上直接鉴定蛋白质并检测翻译后修饰，那将大大有益于蛋白质组学研究。

近年来，利用纳米孔来读取DNA已经取得了很大进展。通过仔细测量DNA穿过时纳米孔的离子电压，生物学家已经能够快速确定序列中的碱基对顺序。事实上，纳米孔测序今年已经完成了整个人类基因组的测序——这在以往是无法实现的。

最近，荷兰代尔夫特理工大学和美国伊利诺伊大学香槟分校的研究人员扩展了纳米孔测序的应用范围，提供了蛋白质测序的概念验证。他们证明，采用纳米孔能够以单个氨基酸的分辨率对蛋白质进行鉴定，且错误率极低。这项成果发表在《Science》杂志上。

作为我们细胞中的生力军，蛋白质是由20种不同类型的氨基酸组成的长肽链。研究人员此次采用了一种称为Hel308的DNA解旋酶，它可以附着在DNA-肽段杂合体上，并以受控的方式拉着它们穿过生物纳米孔MspA。

理论上说，通过狭窄门控的每一步都会产生一种独特的电流信号，因为氨基酸会部分阻挡离子通过纳米孔时携带的电流。

这项研究的第一作者、代尔夫特理工大学的 Henry Brinkerhoff 将这种蛋白质比作一条项链，其上带有不同大小的珠子。他说：“想象一下，当你打开水龙头时，你慢慢地将项链放在下水道里，在这个例子中就是纳米孔。如果是一颗大珠子堵住了下水道，那么流过的水就只是涓涓细流；如果是比较小的珠子，就会有更多的水流过。”

通过他们的技术，研究人员可以非常精确地测定离子电流的量——但不是完全准确的，因为纳米孔的步进式通道是不规则的。不过，他们在液体培养基中加入解旋酶，可以得到同一分子的多个独立而重叠的读数。用他们的话来说，他们可以“倒带”蛋白质，再次读取其氨基酸序列。通过这种做法，错误率从13%降低到几乎为零（<10⁻⁶）。

这种纳米孔测序方法让研究人员能够区分仅有一个氨基酸不同的肽段变异。他们构建只有一个氨基酸改变的合成肽，并显示该系统可以区分它们，从而证明了这一点。

为了读取单个氨基酸，研究人员首先必须知道每个氨基酸在穿过纳米孔时产生的信号。他们发现，其中一些信号可能与直觉不同。例如，当体积庞大的色氨酸通过缩窄通道时，相对于体积较小和中等的变异，离子电流先是减少，然后反直觉地增加。

为了理解这些奇怪的信号，研究团队依靠伊利诺伊大学香槟分校的计算生物学家 Aleksei Aksimentiev开展超级计算机模拟。这种模拟在几台速度最快的超级计算机上进行，包括德克萨斯州高级计算中心的Frontera、美国国家超级计算应用中心的Blue Waters，以及圣地亚哥超级计算机中心的Expanse。

Aksimentiev的团队使用了一种称为分子动力学模拟的方法，以原子分辨率重现了纳米孔、蛋白质和周围介质的行为。这种模拟无法完全捕捉到纳米孔活动的真实时间尺度。但是，通过在不同位置生成 40到50个初始状态，然后并行运行70次模拟，他们能够获得统计数据，以推断肽段的不同构象。根据这些数据，他们计算出电流，并将其与实验电流进行比较。

他们的模拟包括在200到500纳秒内相互作用的30,000个原子，并且能与实验结果相匹配。更重要的是，他们展示了为什么某些氨基酸在穿过纳米孔时会产生违反直觉的信号。对于色氨酸变异来说，信号可以追溯到肽段侧链与缩窄处上方的纳米孔表面的结合。

“对于每个特定的构象，我们都可以看到侧链上发生了什么，它是与纳米孔表面相互作用，还是留在了孔内，”Aksimentiev说。“然后我们就可以直接确定，侧链的结合增强了电流。”

Aksimentiev补充说：“通过这种纳米孔方法来读取单个蛋白质，未来有望开发出诊断方法。计算将在这些技术的开发方面发挥重要作用。令人惊讶的是，有了计算机模型，我们可以重现实验，并判断在纳米规模上发生了什么样的相互作用。”

未来还需要更多的工作来读取超过20个氨基酸的蛋白质，并识别带有不同电荷的氨基酸，但他认为，在三到五年内有望开发出一个工作模型。

通讯作者Cees Dekker表示：“我们认为，这种新方法将帮助我们检测翻译后的变化，从而让我们更深入了解自身携带的蛋白质。”这些概念验证实验也为开发单分子蛋白指纹图谱和分析技术打下了基础。

原文检索

Henry Brinkerhoff, Albert S. W. Kang, Jingqian Liu, Aleksei Aksimentiev, Cees Dekker. Multiple rereads of single proteins at single&ndash;amino acid resolution using nanopores. Science, 2021; DOI: 10.1126/science.abl4381