MMI激光显微切割技术用于人肺FFPE组织空间蛋白组分析

本文介绍了基于MMI激光显微切割技术从H&E染色的人肺FFPE样本中切割出低至0.0125mm³的肺血管和邻近的肺泡，经5% SDS+热处理+Covaris LE220-Plus高通量聚焦式超声系统匀浆后，与5% SDS处理以及5% SDS处理+热处理方法相比，蛋白提取得率明显提高。在保留空间位置信息的前提下通过质谱(MS)分析方法比较了人肺血管以及肺泡中总蛋白和胞外基质蛋白(ECM)的表达差异。该优化方案提高了蛋白质谱检测灵敏度、增加了鉴定出的蛋白种类，可为基于激光显微切割技术的空间蛋白组学研究提供必要的方法学指导。

1. 用基于去污剂的热回收程序，通过逆转固定引起的化学交联，增强蛋白质的溶解度。
2. 提高胞外基质蛋白的提取效率：聚焦式超声系统组织匀浆和尿素缓冲液提取。
3. 使用SuspensionTrap(柱内膜消化系统)增加肽段产量，同时有效地去除样本中的去垢剂和污染物。

本研究中使用的是符合特发性肺纤维化诊断标准但是形态正常的远端肺组织。使用德国MMI公司的CellCut Plus激光显微切割系统对5μm H&E染色人肺FFPE切片进行切割。切割之前首先用CellScan在4×下进行快速的全玻片扫描成像，后续直接在图片上对感兴趣的目的区域进行精细快速圈选。使用60% laser power、50 μm/ sec切割速度进行切割，切割下来的细胞被MMI的收集管盖主动粘附收集，暂时储存在-20°C冰箱。

激光显微切割人肺血管以及相邻的肺泡

质谱前样本制备

激光显微切割的样本被储存在100μl 50nM TEAB溶液中，5% SDS, 7.5 M 尿素, 10 mT DTT (pH 7.5)，转移至Covaris mircotube中，使用LE220-Plus高通量聚焦式超声系统进行匀浆，整个匀浆过程持续10min，温度始终维持低温6°C。匀浆过程可导致大块组织破碎，仅留下细小的物质悬浮液，可让蛋白质充分释放，便于后续的蛋白质提取。LE220-Plus聚焦式超声系统可一次性处理96个样品。经烷基化和酸化的样品上清加入到micro S-Trap柱(ProtiFi)离心直至所有样本过柱。经过9次90%甲醇洗涤后，向柱子上加入胰酶溶液进行消化，洗脱后的120μl样本用Heto冻干系统进行冻干，脱盐后再次冻干以备质谱分析。

质谱前组织制备流程

经LE220-Plus聚焦式超声系统超声处理 + 热处理 + 5% SDS处理的样本蛋白提取得率
比热处理 + 5% SDS处理以及5% SDS处理的样本均要高。

特发性肺纤维化样本中由形态正常的肺泡和血管组成的胞外基质。a图b图显示经质谱鉴定分析出的分别在形态正常的人肺泡和血管中总蛋白数量以及胞外基质蛋白数量。c图显示在肺泡和血管中特异性表达的基因。d图显示序列切片经H&E染色、anti-LamB1和 anti-TNC 染色结果。比例尺代表100μm。

特发性肺纤维化样本中由形态正常的肺泡和血管组成的胞外基质。a图显示激光显微切割的人肺泡（红色）和血管(蓝色)的均一化肽段强度的主要组分分析。点旁边数字代表doner ID。括号里面数值代表每一关键组分差异百分比。b图显示所有1252种蛋白质，c图显示ECM蛋白的火山图，仅显示FDR值的自然对数相对于每种蛋白质的变化以log2为底的对数绘制。设置阈值 log2> 0.5，FDR p值<0.05； n = 3个IPF标本。 紫色点表示在肺泡中表达的已知蛋白，绿色点表示在血管中表达的已知蛋白，蓝色点表示与基质相关的蛋白，红色点表示核心-基质蛋白。

Table1和Table2显示了人肺血管中Top10信号通路以及Top10富集的蛋白类型。Table3和Table4显示了人肺泡中Top10信号通路以及Top10富集的蛋白类型。

作者还做了H&E染色的人肺FFPE组织激光显微切割滴度分析，发现随着激光显微切割组织用量减少，质谱鉴定出的肽数量逐渐减少，在使用最低起始量0.00625 mm³ 组织时，检测的肽数量有明显下降。

本文针对H＆E染色的人肺FFPE组织进行激光显微切割获得均质的肺血管以及邻近的肺泡组织后，通过各种优化的组织预处理步骤，提高蛋白质的提取效率，提高质谱鉴定之前肽段的质量。本文开发了可以使用低至0.0125 mm³的组织样本用于质谱分析的方法学，更重要的是能保留空间位置信息。这种新颖的微蛋白质组学方案有望针对各种病理学的复杂组织进行组学图谱的研究。

参考文献：
Herrera et al. Laser capture microdissection coupled mass spectrometry (LCM-MS) for spatially resolved analysis of formalin-fixed and stained human lung tissues.
Clin Proteom (2020) 17:24