金纳米颗粒定量怎能少了它——NanoDrop One 超微量紫外可见分光光度计

NanoDrop One分光光度计可用于快速准确地分析各种直径AuNPs的SPR和浓度，无需稀释，且上样量少。

金纳米颗粒（Gold nanoparticles，AuNPs）在推动广泛的生物医学应用中发挥了重要作用，包括分子诊断，靶向药物输送，核酸输送和光热疗法。 AuNPs独特的光学性质，生物相容性特征（例如低毒性，低免疫反应性）以及易于合成，促使它被快速应用到了生物医学研究中。AuNPs最重要的特征是其表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR），即当AuNPs被用光照射时发生表面电子的集体振荡。SPR属性取决于AuNPs的大小和形状以及周围的胶体介质。例如，悬浮在水中的13 nm直径的AuNPs的共振峰波长约为520 nm。 AuNPs的SPR特性可用于样品表征，尤其是用于评估悬浮液中AuNPs的浓度，因为根据朗伯比尔定律，样品在共振峰波长处的光密度与浓度相关。

传统测定方法是使用波长为1 cm的UV-Vis（Ultraviolet Visible Absorption Spectroscopy）分光光度计来测量AuNPs在其SPR波长处的光密度。 但是，这种方法存在几个缺点：一是传统分光光度计的固定光程限制了仪器的线性范围。 如果AuNPs样品浓度过高，使其消光系数超出仪器的线性范围，则需要稀释样品，使其消光度落在分光光度计的线性范围内。由于稀释过程中移液误差，会增加测量不准确的可能性。另一个缺点是传统分光光度计需要大量的样品量（范围从0.5 mL到3 mL），在测量过程中AuNPs若被任何表面结合的部分修饰或随后的纯化中被修饰，都可能导致无法使用。
 
Thermo Scientific NanoDrop超微量紫外可见分光光度计可以克服这些缺点，因此特别适合表征AuNPs制剂的SPR光谱测定。该仪器利用短而可变的光程（0.03–1.0 mm），因此无需稀释即可进行高浓度AuNPs制剂的测量。此外，NanoDrop One分光光度计使用较小样品量（1-2μL）即可进行样品测量。 因此，研究人员可以保留其大部分AuNPs制剂以用于下游应用。

NanoDrop是超微量紫外/可见分光光度计的第一品牌。创新的基座设计，使检测过程只需简单的点样、测定和擦拭即可，无需稀释，无需耗材，简便快捷。将实验人员从繁琐的样本稀释和比色杯的清洗工作中解脱出来，从根本上改变了科学家们分析DNA、RNA、蛋白及金纳米颗粒等的检测方法。

美国特拉华大学生物医学工程系的Chintan H. Kapadia等人制备了金纳米颗粒比较了传统分光光度计和NanoDrop One分光光度计在金纳米颗粒定量的区别。首先，参考Frens（参考文献1）的方法合成AuNPs，将氯化金（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）溶解在去离子水中，在回流下煮沸；在剧烈搅拌下加入柠檬酸钠，溶液反应15分钟，直到颜色从浅黄色变为深红色；然后将合成的AuNPs过滤以纯化样品。接下来，使用Zeiss LIBRA 120仪器的透射电子显微镜测量AuNPs的直径，结果表明AuNPs的直径为13nm。传统分光光度法，将AuNPs放在1 cm的比色杯中，用水测基线后在850 nm至450 nm的传统分光光度计上进行扫描，得到峰值SPR波长（521 nm）处AuNPs的光密度（OD）并使用该值计算浓度，其中2.7x108 M-1 cm-1被用作13 nm AuNPs的消光系数。通过计算表明初始AuNPs样品的浓度为12 nM。
 
为了制备各种浓度的样品，12000 xg离心5分钟沉淀AuNPs，然后用水进行系统稀释以制备150 nM至10 nM的样品。 然后使用传统的分光光度计和NanoDrop One分光光度计对这些AuNPs样品的SPR特性进行评估。 传统分光光度法测量高浓度悬浮液中AuNPs的SPR，需要将AuNPs用去离子水稀释100倍。而使用NanoDrop One分光光度计进行分析时不需要稀释，并且在NanoDrop One分光光度计上进行测量，只需取少量大概2 µL样品直接加到样品基座上进行测量，随后使用无屑纸进行清洁即可。NanoDrop One分光光度计测得的UV-Vis光谱和SPR峰与AuNPs浓度相关的标准曲线如图1和图2。

 
图1：在Nanonrop One分光光度计上测得的浓度为10 nM至150 nM的13 nm AuNPs的UV-Vis光谱。

 
图2：NanoDrop One分光光度计测得的521 nm处AuNPs的光密度与已知浓度的线性曲线。显示了10 nM至150 nM的大范围内的线性关系，R2值为0.9996，n=3。表明仪器的测量非常精确，因为所有样品的三次测量的标准偏差在每种浓度下均在各自吸光度值的1％之内。

通过测试，Chintan H. Kapadia等人评价：Thermo Scientific NanoDrop One超微量紫外可见分光光度计是一种非常快速，准确的仪器，可以评估直径13nm的AuNPs的浓度，因为它可以可靠地测量SPR光谱，结合朗伯比尔定律来计算浓度。 与传统的分光光度计相比，NanoDrop One分光光度计的主要优势在于它需要的样品量较少，并带有易于使用的软件，可进行自定义计算。 NanoDrop One分光光度计的高吸收能力和低样品量要求使其非常适合金纳米颗粒浓度测量。尽管此处仅评估了13 nm的AuNPs，但NanoDrop One分光光度计可用于快速准确地分析各种直径AuNPs的SPR和浓度。

UV-Vis光谱扫描操作步骤

1. 在“主页”选择用户自定义，点击紫外-可见光；
2. 如果需要设置检测波长，输入最多40个待检测波长，您也可以在扫描后需要时候再指定，或者不指定；
3. 选择是否需要使用自动化光程调整和基线矫正；
4. 取1-2μl空白检测液点到下基座，放下检测臂（或将空白检测比色皿插入比色皿架）；
5. 点击空白检测并等待完成；
6. 抬起检测臂，擦拭上下基座（或取下空白检测比色皿）；
7. 取1-2μl待测溶液放置到基座上，放下检测臂点击检测（或将样品比色皿插入比色皿架，点击检测）；
8. 检测完成，擦洗上下基座（或取出比色皿）。
 
结果输出：

对于每个检测的样品，此应用显示吸光度光谱和结果摘要。要查看具体报告，可以在显示器上按住样品行显示，或者直接将所有数据用U盘导出。
 
注意事项：

1. 使用和待测样品溶液相同的缓冲液做空白检测；
2. 自动化光程，选择后允许软件为高浓度样品匹配最佳检测光程，避免样品稀释。取消选择所有波长的光程为10mm；
3. 基线矫正，可以输入指定波长（nm）,或者使用默认值750nm。

参考文献
1. Frens, G., Controlled Nucleation for the Regulation of the Particle Size in Monodisperse Gold Suspensions. Nature Physical Science 1973, 241, 20.

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