Cell：首次使用单细胞测序全方位解析新冠病毒（SARS-CoV-2）的发病机制

　　

人类冠状病毒（CoV）是一类单正链RNA病毒，可引起轻度至重度呼吸系统疾病。在过去的二十年里出现了两类高致病性的CoVs: 严重急性呼吸系统综合症（SARS）-CoV和中东呼吸综合征（MERS）-CoV。导致COVID-19疾病的新冠病毒SARSCoV-2于2019年底被首次报道，并迅速在全球扩散。截至2020年4月19日，SARS-CoV-2继续在全球蔓延，185个国家和地区的确诊病例总数超过2401379例，死亡165044例，康复者623903人。COVID-19的特点是肺炎、发烧、咳嗽和偶尔腹泻，并且SARSCoV-2 RNA在鼻咽拭子、痰和粪便样本中被检测到。因此，了解导致COVID-19疾病的严重急性呼吸道综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的发病机制迫在眉睫，这对于COVID-19疾病的预防、治疗，及相关药物的开发至关重要。

新冠病毒S蛋白在宿主细胞上结合ACE2，并与宿主蛋白酶（主要是TMPRSS2）协同作用，促进其进入宿主细胞中。然而，SARS-CoV-2在宿主组织中靶向的细胞子集，以及调节ACE2表达的因素，仍然是个未知数。且人类与SARS-CoV-2之间宿主-病原体相互作用的复杂性至今也是个谜。今年4月20日麻省理工学院（MIT）的科学家们发表在《Cell》上的一篇文章通过分析人类、其他灵长类动物及小鼠的单细胞测序数据，鉴定出了新冠病毒（SARS-CoV-2）的靶向细胞集，并详细解析了其发病机制，为防治这一流行病及解决药物的耐药性问题提供理论基础。

鉴定灵长类动物SARS-CoV-2宿主细胞类型

为了探究人类和其他灵长类动物SARS-CoV-2的宿主细胞类型，研究人员首先分析了灵长类动物猕猴肺组织的scRNA-seq数据集，以评估哪些细胞类型标记为ACE2或TMPRSS2阳性细胞。最终鉴定出了17种不同的主要细胞类型，包括各种淋巴细胞、髓细胞和基质细胞（图1A-C）。同时发现ACE2和TMPRSS2主要在上皮细胞中表达，6.7%的II型肺泡细胞表达ACE2，3.8%的细胞共同表达ACE2和TMPRSS2（图1B-C），且在ACE2阳性II型肺泡细胞中观察到II型IFN的受体IFNGR2表达量显著上升（图1D）。

图1.猕猴肺组织单细胞转录组图谱

鉴定人类SARS-CoV-2宿主细胞类型

为了探究人肺组织中是否具有类似的细胞图谱，我们通过scRNA-seq方法分析了外科手术切除的纤维化肺组织的细胞类型，鉴定出了多种细胞类型及免疫细胞亚型（图2A-C）。ACE2和TMPRSS2主要在II型肺泡细胞和纤毛细胞中表达，这与猕猴中的单细胞测序结果一致（图2B）。对ACE2+/TMPRSS2+II型肺泡细胞和其他类型II型肺泡细胞的基因表达模式进行分析，发现ACE2+/TMPRSS2+细胞中BATF基因显著富集（图2C-D），此基因以前被报道受I型和II型IFNs的调控，且ACE2与HIV有关（图2E）。这些结果表明，在人和其他灵长类动物呼吸道中发现了一些共有的ACE2+/TMPRSS2+细胞群，且不少证据显示IFN相关炎性信号促进这些受体的表达。

图2.人肺组织单细胞转录组图谱

胃肠道ACE2+细胞分布情况

SARS-CoV-2不仅在呼吸道中被检测到，在粪便中也发现这种病毒的存在。接下来作者分析其他组织，主要是胃肠道ACE2+细胞的分布情况。通过猕猴的单细胞测序数据发现，ACE2+细胞主要分布于小肠中，在肝脏和结肠中也能检测到少量的ACE2+细胞（图3A），并鉴定出ACE2+细胞为吸收性肠细胞（图3B-C）。13个儿童的内窥镜回肠末端活检样本单细胞测序数据也证实ACE2+细胞集中于吸收性肠细胞（29.7%）（图3D-E）。

图3.猕猴和人胃肠道单细胞转录组图谱

上呼吸道中ACE2+细胞富集情况

鼻腔和鼻窦组织是冠状病毒的主要暴露部位，是潜在的病毒靶细胞，接下来作者分析了上呼吸道中SARS-CoV-2宿主细胞基因表达情况。健康人上呼吸道（下鼻甲和筛窦粘膜）及慢性鼻窦炎致过敏性炎症的患者的单细胞测序数据显示，ACE2基因主要在尖端上皮细胞中富集（图4A-B）。为了更精确地描绘SARS-CoV-2的靶上皮细胞亚群，作者采用精细的聚类分析方法，鉴定出13种上皮细胞亚群，并对他们的基因表达模式进行分析（图4C-F）。ACE2+/TMPRSS2+细胞亚群中与IFN信号相关的ADAR、GBP2、OAS1、JAK1 和 DUOX2基因表达显著上升（图4G），且在ACE2_/TMPRS2+细胞亚群7（图4I）中发现了IFNa刺激基因集。

图4.人上呼吸道单细胞转录组图谱

ACE2与IFN相关性分析

小鼠气管上皮细胞、人支气管细胞系BEAS-2B，两例捐献者的上呼吸道基底细胞的平行实验显示，经IFN刺激后，对应的细胞中ACE2基因表达升高（图5A-D），且成剂量依赖性（图5I-L）。另外，干扰素刺激基因（ISG）STAT1/stat1与ACE2的基因表达密切相关，且在人上呼吸道基底细胞中这两者具有更高的相关系数（图5E-H）。这些结果暗示着ACE2很可能是屏障组织内上皮细胞中以前未被重视的ISG。

图5.基因相关性分析

机制探究

鉴于在体外的小鼠细胞实验中Ace2的轻微上升，我们好奇的是Ace2在体内是否代表一种鼠源ISG。将IFNa腹腔注射于小鼠体内，12小时后分离出鼻粘膜，包括呼吸上皮和嗅觉上皮，收集样本进行单细胞测序。共收集了11358个细胞，鉴定出迄今为止最大的小鼠呼吸和嗅觉粘液单细胞图集，包括上皮细胞、基质细胞、神经元和免疫细胞等（图6A-B）。在Ace2+细胞的丰度最高的基底上皮细胞中，IFNa治疗后小鼠中一些典型的ISGs表达量急剧上升，而Ace2基因表达略微上升（图6C-D），这与小鼠体外细胞实验结果一致。

最终回到实际问题中，对18名甲型流感病毒或乙型流感病毒确诊个体的鼻洗剂样本进行scRNA-seq研究，从35840个细胞中鉴定出了17种不同的细胞类型（图6E）。基因富集分析结果显示，与病毒直接接触的杯状细胞和非直接接触的鳞状细胞中ACE2的表达量最高（图6F-G），ACE2+TMPRSS2+杯状细胞在流感病毒感染期间CXCL9/10/11等经典的ISGs表达量急剧上升。这些结果证实，ACE2是人原发性上呼吸道基底细胞中的一种ISG，而小鼠的Ace2并不是。

图6.IFNa腹腔注射小鼠鼻粘膜组织及流感患者鼻洗剂样本单细胞转录组图谱

总结与展望

本文利用人类、非人类灵长类动物和小鼠单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集，在各种组织和疾病样本中发现SARS-CoV-2的靶细胞为ACE2+/TMPRSS2+细胞，这些细胞包括II型肺泡细胞、吸收性肠细胞及鼻杯状分泌细胞。人呼吸道上皮细胞体外实验及病毒感染体内实验证实，ACE2是一种人干扰素刺激基因（ISG）。SARS-CoV-2通过组织特异性的上调ACE2（一种肺损伤中起保护作用的因子）表达来增强感染。

scRNA-seq的应用，使我们更好地了解在体外和体内病毒感染期间存在的细胞变异，在突发公共卫生挑战期间能够迅速共享关键数据，增进我们对疾病的了解。

参考文献：
Ziegler, C.G.K., Allon, S.J., Nyquist, S.K., et al. (2020). SARS-CoV-2 receptor ACE2 is an interferon-stimulated gene in human airway epithelial cells and is detected in specific cell subsets across tissues. Cell 181, 1016-1035.e19.