首都医科大学团队揭示外泌体miRNA促进结直肠癌转移的机理

肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是与癌症转移相关的重要免疫细胞。不过，TAM是否在结直肠癌肝转移中起主导作用还不清楚。近日，首都医科大学的研究团队在《Cancer Letters》杂志上发文称，外泌体miRNA通过增强巨噬细胞的M2极化，促进CXCL12/CXCR4-诱导的结直肠癌肝转移。这些结果为避免结直肠癌转移提供了潜在的治疗靶点。

结直肠癌（CRC）是常见的消化道肿瘤，其发病率和死亡率在全球范围内呈上升趋势。尽管这种疾病的治疗效果有了很大的改善，但由于发生肝转移，患者的预后仍然很差。据统计，大约50%的结直肠癌患者在病程中出现肝转移，是导致患者死亡的主要原因。

近期的多项研究表明，CXCL12/CXCR4轴的激活在结直肠癌肝转移中起了关键作用，但具体机制还不大清楚。同时，基于癌症转移的“种子和土壤”理论，转移前niche的形成还需要肿瘤细胞与基质细胞之间的交流，以促进肿瘤的生长和发展。肿瘤相关巨噬细胞在此过程中通常维持M2极化状态，以促进癌症转移。

那么，促进巨噬细胞M2极化的信号来自哪里？最近有人提出，癌症来源的外泌体（exosomes）通过转移miRNA来指导转移的器官倾向性。的确，外泌体miRNA常常充当调节肿瘤生长、血管生成和转移的信号分子。于是，研究人员假设，表达CXCR4的结直肠癌细胞通过外泌体转移miRNA来促进巨噬细胞的M2极化，最终促进结直肠癌转移。

高表达的CXCR4促进M2极化

为了探索CXCR4是否招募巨噬细胞并促进巨噬细胞的M2极化，研究人员将CXCR4^+/-转基因小鼠（肠道上皮细胞过表达CXCR4的小鼠，由赛业生物提供）与Apc^Min/+小鼠杂交，产生CXCR4^+/-Apc^Min/+复合突变小鼠。Apc^Min/+小鼠的Apc存在生殖系突变，会导致小鼠易患自发性结肠和肠道肿瘤，因此，这种小鼠可作为自发性结肠癌模型，以鉴定CXCR4的促肿瘤作用。

研究人员发现，与Apc^Min/+小鼠相比，CXCR4^+/-Apc^Min/+小鼠的结肠腺瘤数量显著增加。同时，CXCR4的高表达导致M2标志物CD163的表达显著增加，而CXCR4^+/-Apc^Min/+小鼠的结肠粘膜中也观察到M2巨噬细胞的浸润增加。有意思的是，CD163的表达主要位于结直肠癌的浸润前沿和基质。这些结果表明，CXCR4的激活与TAM浸润强度的增加之间存在着潜在的关联。此外，通过临床标本的分析，他们还发现CXCR4的表达与M2标志物CD206存在相关性，突出了CXCR4在结直肠癌微环境中的潜在调节作用。

来自肿瘤细胞的外泌体miRNA诱导M2极化

越来越多的研究表明，癌细胞大量分泌外泌体，并将信号分子转移到周围细胞中。为了鉴定那些导致巨噬细胞极化状态发生改变的外泌体miRNA，研究人员从感染了对照（HCT116-Control）、CXCR4慢病毒（HCT116-CXCR4）或经过CXCL12处理（HCT116-CXCR12）的HCT116细胞中分离出外泌体，并利用miRNA芯片开展分析。他们发现，三种miRNA（miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p）在来自HCT116-CXCR4 和HCT116-CXCL12细胞的外泌体中显著上调，表明这些miRNA是在CXCL12/CXCR4激活后高度上调的。

为了证明这些miRNA可通过外泌体从结直肠癌细胞转移到巨噬细胞，他们用FAM标记的miRNA转染HCT116细胞，并与PMA诱导的THP-1细胞共培养24小时。通过共聚焦显微镜可以在巨噬细胞中检测到FAM标记的miRNA，这意味着miRNA可以通过外泌体从结直肠癌细胞转移到巨噬细胞。之后，他们将小鼠巨噬细胞和PMA诱导的THP-1细胞与来自HCT116-control、HCT116-CXCR4和HCT116-CXCL12的外泌体共同孵育，发现以上三种miRNA的水平在与HCT116-CXCR4 和HCT116-CXCL12外泌体孵育的巨噬细胞中显著上调（图1）。

为了探索这些高度上调的外泌体miRNA对巨噬细胞极化的影响，研究人员在经PMA诱导的THP-1细胞摄取外泌体后，测定了M2标志物（CD206和Arg-1）以及M1标志物（iNOS和TNFα）的表达水平。与对照细胞相比，来自HCT116-CXCR4或HCT116-CXCL12细胞的外泌体显着增加了CD206和Arg-1的表达，同时降低了iNOS和TNFα的表达。此外，miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p的模拟物显著增加了M2标志物的表达，并降低了M1标志物的表达；而miRNA抑制剂则显著抑制了M2标志物的表达，显示了这些miRNA调节巨噬细胞极化的特异性。

图1. miRNA被巨噬细胞吸收并引发M2极化表型。

外泌体miRNA通过PTEN/PI3K/Akt信号通路促进M2极化

研究人员随后利用miRNA目标预测算法来确定这些miRNA的潜在下游靶点，发现PTEN是它们的共同靶点。为了确定这一点，他们分别用三种miRNA的模拟物和抑制剂来转染THP-1细胞，发现miRNA模拟物显著抑制了PTEN的表达，而miRNA抑制剂大大增强了PTEN的表达，其中miR-425-5p对PTEN的表达表现出最强的负调控潜力，表明PTEN是这些miRNA的潜在靶点。同样地，Akt的表达也受到这些miRNA的负向调控，表明PTEN/PI3K/Akt是协调巨噬细胞极化的关键信号通路（图2）。

他们利用miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p模拟物转染鼠巨噬细胞Raw264.7和PMA诱导的THP-1细胞，发现PTEN的表达明显降低以及PI3K-Akt信号通路的激活。同时，c-Myc、STAT3和STAT6被激活并磷酸化，以增强巨噬细胞的M2极化。与预期的结果一致，M1表型标志物iNOS的水平降低，而M2表型标志物Arg-1的表达大大增加。这些结果表明，miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p从结直肠癌细胞转移到巨噬细胞后，通过PTEN/PI3K/Akt信号通路协同增强了巨噬细胞的M2极化。

 
图2. 外泌体miRNA通过PTEN/PI3K/Akt信号通路促进巨噬细胞的M2极化。

M2极化的巨噬细胞促进EMT和血管生成

为了探索M2极化的巨噬细胞对结直肠癌侵袭和转移的影响，研究人员将巨噬细胞与结直肠癌细胞共培养。他们发现，转染miRNA模拟物后的THP-1和Raw264.7细胞明显增强了迁移能力，并促进了结直肠癌细胞的上皮间充质转化（EMT）。之后，通过细胞因子分析，他们发现经miRNA转染的Raw264.7细胞条件培养基中VEGF这种血管生成因子显著增加。同时，血管形成实验的结果也表明，M2极化巨噬细胞分泌的VEGF可显著促进HUVEC细胞的血管形成，表明促血管生成作用是巨噬细胞引发结直肠癌侵袭的机制之一。

为了进一步评估外泌体miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p在巨噬细胞表型转换中的作用，研究人员以4:1的比例将结直肠癌细胞与转染了miRNA模拟物的巨噬细胞混合，然后将这些细胞注射到裸鼠的侧腹。他们发现，这些巨噬细胞的共注射会导致异种移植瘤的体积明显增加。而且，巨噬细胞的促肿瘤作用可通过IL-4的处理而得到加强。之后，他们还发现在转染miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p的THP-1细胞中，小鼠出现了更多的肝转移结节。这些结果表明转染miRNA的巨噬细胞在体内促进了肿瘤进展和肝转移（图3）。

图3. 转染miRNA的巨噬细胞促进了肿瘤进展和血管生成。

血清中的外泌体miRNA与结直肠癌患者的转移相关

最后，为了确定结直肠癌患者血清中的外泌体miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p水平是否升高，研究人员从健康供体和结直肠癌患者的血清中提取出循环外泌体。RT-qPCR显示，结直肠癌患者的循环外泌体水平上调。而且，与没有转移的患者相比，转移性结直肠癌患者的循环外泌体中miR-25-3p和miR-130b-3p的水平升高。这些数据表明，循环外泌体中的miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p水平可作为预测结直肠癌患者进展和转移的非侵入性方法。

作者总结道：“我们证明，结直肠癌细胞在响应CXCL12/CXCR4激活时，通过外泌体转移一组miRNA（miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p）而促进巨噬细胞的M2极化，从而增强EMT和结直肠癌肝转移（如下图所示）。”他们认为，外泌体miRNA不仅可以作为预后的预测工具，还可以作为避免结直肠癌转移的潜在治疗靶点。

（生物通 余亮）

原文检索

D. Wang, X. Wang, M. Si, J. Yang, S. Sun, H. Wu, S. Cui, X. Qu, X. Yu, Exosome-encapsulated miRNAs contribute to CXCL12/CXCR4-induced liver metastasis of colorectal cancer by enhancing M2 polarization of macrophages, Cancer Letters, https://doi.org/10.1016/j.canlet.2020.01.005.