知己知彼，科学抗疫 — 质谱流式在呼吸道病毒研究中的应用和进展

　　

“ 流行性感冒跟感冒根本不是一家人，我如果告诉你流行性感冒是老虎，那你说感冒是什么呢？我告诉你，感冒连兔子都不是，它可能是小爬虫，可能就是苍蝇。就是差的这么远。”

-----复旦大学附属华山医院感染科主任
张文宏 教授

流感病毒和新型冠状病毒（SARS-CoV-2）都属于可引起呼吸道疾病的病毒。可引起呼吸道感染的病毒种类繁多，除了我们熟知的上述两大病毒，还有副流感病毒、鼻病毒、腺病毒、风疹病毒以及其他类型的冠状病毒等。这些病毒以呼吸道为侵入门户，引起呼吸道局部感染或呼吸道以外组织器官的病变。

我们整理了质谱流式在流感病毒和鼻病毒方面的研究成果，希望为呼吸道病毒研究人员提供一些参考。

01 流感病毒研究

流行性感冒（简称流感）是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一种传染性强、传播速度快的疾病。引起人类呼吸系统感染的流感病毒属于正粘病毒科，对细胞表面的粘蛋白有亲和性，有包膜，是具有分节段RNA基因组的一类病毒，常见的有流感病毒属的A(甲)、B（乙）、C(丙)三种类型，目前没有D型流感感染人的事件发生，但是有科学文献指出，D型流感可能具有感染人类的潜能【1】。

流感病毒在世界各地常会有周期性的大流行，症状与有轻微有严重，与普通的伤风感冒容易混淆，普通民众容易掉以轻心，但实际上流感每年影响大约10亿人，导致290,000至650,000例死亡【2】。年幼的儿童和免疫功能低下的人特别容易患上由流感引起的严重疾病。

对于孕妇来说，在怀孕期间，免疫系统必须在维持抵抗微生物挑战的能力的同时，很好地平衡自身的活动以耐受半异基因胎儿。这些免疫系统的改变可能至少部分增加了孕妇对流感病毒感染并发症的易感性。前期的研究表明，在怀孕期间，几个天然免疫细胞亚群，包括单核细胞、浆细胞样树突状细胞和自然杀伤（NK）细胞，对流感病毒的反应增强，但是NK细胞在病毒发病作用中的作用仍不清楚。在Le Gars等2019年发表在《Frontiers in Immunology》的文章里，研究人员发现在怀孕期间，CD56dim和CD56bright 这两个主要的NK细胞亚群对流感病毒感染细胞的反应增强。为了更好地理解在怀孕过程中驱动NK细胞反应的增强机制，研究人员使用质谱流式系统分析了孕妇和非孕妇中的CD56dim和CD56brigntNK细胞。通过含有20个marker的panel对怀孕与非怀孕队列样本的精细研究发现孕妇NK细胞中一些功能和活化的marker如CD38和NKp46的表达显著增加，而趋化因子受体CXCR3的表达在怀孕过程中减少。之后，研究人员用28个marker的panel对另一组队列样本深入分析验证了此发现。总体而言，这些数据表明，怀孕期间NK细胞发生功能和表型改变，可能影响流感病毒感染后免疫反应的强度【3】。

在人类流感感染中，特别是在大流行菌株中，细胞因子反应的大小可以预测疾病的严重程度。在NK细胞分泌的细胞因子中，IFN-γ的产生对病毒清除和适应性免疫反应的发展至关重要【4】，但作为细胞因子风暴的一部分，IFN-γ和其他细胞因子的过量产生与人类流感感染的不良结果相关。来自斯坦福大学医学院的研究发现，在T细胞缺失的情况下，流感病毒依赖于细胞因子以及受体-配体相互作用的信号来触发NK细胞分泌IFN-γ，并加以调控，以此实现免疫逃逸的策略。譬如， H3N2型流感毒株通过下调NK细胞活化配体CD112和CD54，并通过病毒复制依赖的方式抑制I型IFN应答，从而抑制NK细胞IFN-γ应答。相反，H1N1型流感毒株未能抑制I型IFN应答，或同样程度下调CD54和CD112的表达，导致NK细胞IFN-γ应答增强【5】。

除了NK细胞的调控作用，抗原特异性T细胞对于宿主抵抗病毒和其他疾病的保护性免疫起着至关重要的作用。质谱流式细胞术结合组合的多重四聚体染色的使用已成功地用于探测和鉴定人类血液样本中的多种抗原特异性CD8+ T细胞。来自新加坡科学技术研究局（A*STAR）的研究表明，通过使用双重编码方法，研究人员可以在不相关肽段作为参照的情况下，检测到五种流感特异性MHCI肽四聚复合物以及一种流感特异性MHCII肽复合物，因此该方法能够追踪各个淋巴结和肺中的抗原特异性T细胞。利用质谱流式技术同时分析与流感表位反应的T细胞的26个表面marker，结果显示针对相同致病抗原决定簇的CD4+ T细胞之间具有组织特异性表型差异。这种方法为快速而全面地分析不同疾病背景下的抗原特异性CD8+ 和CD4+ T细胞提供了可能【6】。

02 鼻病毒研究

鼻病毒(Rhinovirus, RV)是导致普通感冒的主要原因, 属于小RNA病毒科。普通感冒临床症状表现较轻，大多仅表现为鼻塞、低热、流鼻涕、咽痛、头痛等。一方面鼻病毒对普通人群有很高的感染率，另一方面感染患者长期呼吸道紊乱病症逐渐恶化，鼻病毒每一年都造成巨大的卫生和经济负担。

通过研究，人们很早就发现鼻病毒感染会诱导产生中和抗体，然而这些抗体在几个月后减弱，而且在多种RV病毒株感染时，抗体也没有表现出交叉保护的特性。尽管对感染RV的人的抗体反应进行了40多年的研究，但对人类RV特异性B细胞的性质仍一无所知。为了分析人类RV特异性B细胞反应，来自美国弗吉尼亚大学的研究人员构建了RV-A16和RV-A39病毒感染模型，结合质谱流式技术开发了一种高维、平行评估抗体同种型的方法。

在此研究中，科研人员使用了barcoding的策略，对抗-CD45和抗-MHCI抗体用8种不同的金属同位素标记，把染色后的样本pooling在一起进行质谱流式分析。这使得所有的样品都可以在相同的条件下制备，并在一个run中检测，从而最大限度地避免了批次效应，降低了罕见B细胞亚群变化信息被淹没的可能性。研究中共分析了来自24名受RV-A16 (n = 13)或RV-A39 (n = 11)感染的受试者3个时间点的70个样本。

图：根据marker的表达利用FlowSOM算法将B细胞分为50个亚群

通过这种方法研究发现T-bet + B细胞可结合两种病毒，约占CXCR5-记忆B细胞的5％。这些B细胞在感染后浸润鼻组织并在血液中扩增。它们在体外快速分泌异质型的免疫球蛋白G（IgG），但不分泌IgA，与感染后的鼻组织内的抗体谱特征一致。与之相反的，结合单个病毒的CXCR5 +记忆B细胞在克隆上是不同的，分泌同型IgG和IgA，在鼻组织中不存在。这两种记忆B细胞的时间和空间的功能可能解释了为什么人类可以通过免疫系统解决掉鼻病毒但同时在整个生涯中仍旧容易受到再次感染【7】。

小结：

呼吸道传染病由于传播途径容易实现，传播速度快，极容易发展成突发性的公共卫生事件。90%以上的急性呼吸道感染由病毒所引起。为有效控制呼吸道传染病,除需不断完善传染病监测预警系统外,还要尽可能深入地研究病毒的致病机理以及与机体的免疫应答机制从而适应疾病流行的新特征和新形势。质谱流式技术作为一个出色的单细胞超多参数分析平台必将在呼吸道病毒的研究发挥重要的作用。

参考文献

[1] https://en.wikipedia.org/wiki/Influenza
[2] Influenza and antiviral resistance: an overview. Lampejo T.Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2020 Feb 13. doi: 10.1007/s10096-020-03840-9. Review.
[3] Pregnancy-Induced Alterations in NK Cell Phenotype and Function.     Le Gars M, et al. Front Immunol. 2019 Oct 23;10:2469. doi: 10.3389/fimmu.2019.02469. eCollection 2019.
[4] NK cells regulate CD8+ T cell priming and dendritic cell migration during influenza A infection by IFN-γ and perforin-dependent mechanisms.
Ge, M. Q., et al.J. Immunol. 189: 2099–2109.
[5] Differential induction of IFN-α and modulation of CD112 and CD54 expression govern the magnitude of NK cell IFN-γ response to influenza A viruses. Kronstad, L.M. et al. Journal of Immunology 201 (2018): 2,117–2,131.
[6] Multiplex peptide-MHC tetramer staining using mass cytometry for deep analysis of the influenza-specific T-cell response in mice
Fehlings M, et al.
J Immunol Methods. 2018 Feb;453:30-36. doi: 10.1016/j.jim.2017.09.010.
[7] T-bet+ Memory B Cells Link to Local Cross-Reactive IgG upon Human Rhinovirus Infection
Eccles JD, et al.
Cell Rep. 2020 Jan 14;30(2):351-366.e7. doi: 10.1016/j.celrep.2019.12.027.

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