PacBio HiFi测序结合CRISPR靶向捕获检测BRCA1基因中新型致病变异

BRCA1是一个我们熟知的乳腺癌相关基因，但基于其基因序列结构的复杂性，以及现有技术的局限，依然难以确认准确的致病变异。如今，基于高准确度长读长的HiFi测序，将能够更为清晰的呈现复杂非编码区域的变异，为寻找致病变异提供全面的信息。

为了对华盛顿大学医学和基因组科学系的科学家Mary-Claire King在人类基因组研究方面做出的巨大贡献，美国人类遗传协会与近期，向Mary-Claire King女士颁发了威廉•艾伦奖。Mary-Claire King是乳腺癌相关的重要基因BRCA1和BRCA2的发现者，也是乳腺癌研究的一位传奇人物。

在上个月，华盛顿大学著名学者Mary-Claire King及其团队将CRISPR-Cas9靶向方案与HiFi测序相结合，揭示了BRCA1基因中新的和生物学相关的突变，相关文章发表在了最新的Journal of Medical Genetics杂志上¹。

针对BRCA1和BRCA2基因中变异的检测，应用于乳腺癌诊断，尽管我们已经开发了多种基于外显子及内含子侧翼的捕获的短读长测序技术试剂盒，但BRCA1基因所在的区域，存在的复杂的结构变异，例如倒位，移动元件的插入等，却依然难以发现。BRCA1基因所在的基因组区域，包含了42%的Alu重复，并且在启动子和前两个外显子之间分布了约30 kb的串联重复。对于短读长测序技术来说，这样的结构非常棘手。

而在Mary-Claire King的这项研究中，选择了19个有早发乳腺癌史家系的个体，这些个体在过去都使用过全外显子测序技术，基因panel等手段进行了检测和分析，但均没有发现有关早期乳腺癌易感性的致病性突变。

为了靶向BRCA1和BRCA2两个感兴趣的基因，并且为了避免GC富集区域导致的PCR富集困难，研究小组使用了Sage Science基于HLS-CATCH CRISPR的靶向方法，富集了长达200 kb的目的片段高分子量DNA，后续采用PacBio HiFi技术在Sequel系统上进行测序。平均测序片段长度约为10,000 bp，可以完全覆盖两个BRCA位点，包含了非编码元件。

  
图1：Sage Science HLS系统及其HLS-CATCH CRISPR的靶向方法的原理²，可以实现高GC区域的有效富集

图2：PacBio HiFi测序原理及其优异的准确度表现

通过这一靶向方案，结合高准确度，长读长的PacBio HiFi测序，研究人员在内含子中发现了一个由SINE-VNTR-Alu（SVA）逆转座子构成的2,856 bp的插入，可在BRCA1的转录中产生假外显子，引起过早的截断。而这一插入变异在过去的数据中，甚至是最新采用长读长测序技术进行结构变异的分析中³，都从未被报道过。

 
图3：BRCA1基因的13号内含子上，2,856 bp的SVA插入

这一2,856 bp的SVA插入位于17号染色体，BRCA1基因的13号内含子上。同时，研究人员们也发现，它与1号染色体上的一个相应区域，有着98.6%的序列相似。

而PacBio长读长多次读取的HiFi技术，在序列读取方面，能够对野生型中内含子侧翼序列，及所有的变异元件进行更为精确检测，从而更加清晰的呈现了相关变异。

基于这一发现，作者也提到，“或许还有更多的致病性复杂结构变异”，“复杂的突变很可能在肿瘤抑制基因上很常见，但目前我们往往受限于现有的检测方法而难以洞察。”PacBio HiFi测序，结合CRISPR–Cas9靶向捕获技术，则能够有效的检测各种复杂非编码的结构变异。

参考文献：

1. Walsh, Tom, et al. "CRISPR–Cas9/long-read sequencing approach to identify cryptic mutations in BRCA1 and other tumour suppressor genes." Journal of Medical Genetics (2020).
2. https://sagescience.com/wp-content/uploads/2020/03/AGBT-202-POSTER-BO-ZHOU.pdf
3. Audano, Peter A., et al. "Characterizing the major structural variant alleles of the human genome." Cell 176.3 (2019): 663-675.

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