全文详解意大利新冠病毒早于19年9月传播的论文

新冠病毒到底是否起源中国，一直很受关注。最近一篇意大利发表的论文提供了血清学证据表明早在2019年9月已在意大利多地区志愿者中发现抗新冠的功能性中和抗体，引起广泛关注，我们来详细看看作者怎么说

　　

摘要 

目前还没有关于真正的有关新型冠状病毒2(SARS-CoV-2)在世界范围内感染和发病的可靠数据。 我们调查了在2019年9月至2020年3月间参加前瞻性肺癌筛查试验的959名无症状个体的血液样本中存在SARS-CoV-2受体结合域(RBD)特异性抗体，以跟踪意大利各地区病毒出现时间、频率、随时间和地理位置的变化。在959 例样品中，111例(11.6%）检测到SARS-CoV-2 RBD特异性抗体，其中从2019年9月开始，14%的9月样本抗体阳性，2020年2月第二周>30%的样本抗体阳性，伦巴第地区（Lombardy）的抗体阳性比例最高(53.2%）。 这项研究显示，在意大利第一个病人被确诊前几个月，SARS-CoV-2已经在意大利的无症状个体中出现了意想不到的早期传播。 在意大利COVID-19爆发前在无症状人群中发现SARS-CoV-2抗体可能会重塑流行病的历史。

    在2019年12月底，引发严重肺炎的新型严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2)在中国湖北武汉最先得到确认。COVID- 19病毒性疾病在全世界迅速蔓延，世界卫生组织于2020年3月宣布进入大流行状态(www.who.int)。 意大利前两例COVID-19疾病记录于2020年1月30 日，当时来自中国的两名游客在罗马检测到SARS-CoV-2 阳性。第一个经实验室确认的意大利COVID-19病例于2020年2月20日在伦巴第地区发现，一名38岁的男子，没有可能接触阳性病例的历史。 在几天内，在周围地区记录了更多的COVID-19和危重病人病例。不久，在意大利其他地区，主要是北部地区发现了一些病例。首先在伦巴第和威尼托的两个关键地区实施封城，3月8日开始在区域乃至全国迅速实施封城措施。

鉴于第一个病例，有推测该病毒自2020年1月以来一直在意大利传播。 然而，迅速蔓延、大量病人需要住院治疗和在重症监护病房接受治疗以及大流行的持续时间表明，可推测病毒可能以症状较轻的形式到达意大利并在意大利传播已有几个月时间。

血清学检测可用于研究SARS-CoV-2感染导致的抗体反应，并评估其实际流行情况。COVID-19患者的研究表明，几乎100%的重症病人在出现症状后的13天内会出现抗SARS-CoV-2的IgG或者IgM抗体反应。为了检验“病毒在意大利早已存在”的假设，我们用专有的SARS-CoV-2结合和中和抗体分析方法研究了样本库中一组959个无症状个体的血浆样本，分析了群体中SARS-CoV-2暴露的频率、时间和地理分布特征。该组人群于2019年9月至2020年3月通过SMILE试验(肺流行病的筛查和多重干预 ；临床试验.gov 编号：NCT03654105)注册，这是一项使用低剂量计算机断层扫描和血液生物标志物的前瞻性肺癌筛查研究，经我们的机构审查委员会和伦理委员会批准。所有符合条件的参与者都提供了书面知情同意。

检测方法采用实验室自研的受体结合区域（RBD）特异性酶联免疫吸附试验 (ELISA)和基于CPE的活病毒微中和分析。（注意！这是这篇意大利论文在中国学者中最受质疑的地方，文末有详解）

总之，397名患者（41.4%）是女性，63.2%是55-65岁，76.8%是现吸烟者，92.9%吸烟⩾30包/年。 总的来说，959份血浆样本中有111份（11.6%）显示有SARS-CoV-2RBD 特异性抗体(IgM、IgG或两者兼而有之)。 特别是在 97例（10.1%）患者中检测到IgM抗体；在16例患者中发现IgG抗体（1.7%，部分兼有两种抗体）。所有患者在采集血样时均无症状。 表1显示了在意大利内根据样品采集时间划分的抗SARS-CoV-2 RBD 抗体检测阳性分布。 在2019年9月至10月的前2个月，9月采集的162分样本中有23 份（14.2%)显示有 IgG或IgM抗体，10月采集的166份样本中27份(16.3%）患者样本显示 IgG或IgM抗体阳性，或两者兼而有之。最早的阳性样本 (IgM-阳性)记录来自9月3日的威尼托Veneto地区，然后是9月4日来自Emilia Romagna的一例、Liguria一例（9月5日）、Lombardy一例 (Milano省；9月9日)和Lazio一例（罗马；9月11 日）。截止到9月底，23个阳性样本中有13个（56.5%） 记录来自伦巴第，三个在威尼托，两个在皮埃蒙特，一个在Emilia Romagna，Liguria，等等。

 

图1中的图表说明了2019年9月至2020年2月阳性样本比例随时间的变化。值得注意的是，两个抗SARSCoV-2RBD 抗体阳性的峰值：第一个峰值开始于9月底，在10月的第二周和第三周分别达到18%和17%的IgM阳性占比。 第二峰值发生在2020年2月，第二周Ig M阳性病例占比超过30%。 在这组16个阳性样本中，11 个（68.7%）来自伦巴第。

SMILE研究最后一次志愿者招募在3月10日，补充表S3是959名招募志愿者和其中111名SARS-CoV-2 RBD抗体检测阳性样本在意大利境内分布情况与3月10日意大利确认COVID-19患者的分布情况相比结果。 这959名被招募的志愿者来自意大利所有地区，在13个地区都至少检测到一名 SARS-CoV2阳性患者。 根据从意大利卫生部网站收集的数据，伦巴第是受这一流行病影响最严重的地区，10141名被检测者中有5791名（57.1%）COVID-19患者，对应研究中伦巴第招募的志愿者人数最多（491/959 ，占51.2% ） 。而 111例抗体阳性案例中伦巴第占59例（53.2%），其次是Piedmont 和Lazio(10例），后略

用基于细胞病变效应(CPE)的活病毒微中和实验（生物安全二级实验室）对所有111个SARSCoV-2 RBD阳性样品进行了抗SARS-CoV-2功能性中和抗体(NABS)评估。在111例SARS-CoV-2 RBD阳性案例中，6例在定性的CPE微中和试验中呈阳性，其中10月收集的样本有四个（7日两个，8日和21日各一个），11月一个，2月一个；其中三个阳性NAB样本来自隆巴迪，一个来自拉齐奥，一个来自托斯卡纳，一个来自ValleD‘Aosta。 2019年10月初的样本中存在功能性抗SARS-CoV-2 中和抗体，进一步支持病毒早在12月之前已经在意大利，特别是在伦巴第地区的传播。

部分略

    需要突出和讨论两个现象。 第一个问题是低估了案例的普遍性。地区和国家卫生当局在试图尽早查明病例和疑似病例、并追踪所有潜在接触者之后，很快放弃了这一企图，认为这是不可持续的，并将重点放在仅针对症状性病例的拭子和血清学确认。因此，对COVID19病例的总体估计被低估，并引入了选择偏差，高估了死亡率。 在2020年2月22日至5月29日期间， 对威尼托地区主要医院的8285名医护人员进行了 SARS-CoV-2感染的检测。通过测量特异性抗体，观察到4.6%的总体流行率。 尽管在重症患者中100%可以检测到抗体，但是轻症患者患者的血清阳性率较低(83%），无症状个体的阳性率最低(58%）。5月25到7月15日之间，意大利卫生部进行了一项大型SARS-CoV-2 血清阳性研究，样本量达64660人，总体阳性率2.5%，伦巴第地区达到7.5%，Bergamo省高达24%.。由此推出实际接触病毒人数可能达到150万，大多数无症状，是官方报道数据5倍之多。

   第二个值得关注的是疫情的开始，这很可能是在第一个病例确诊之前，可能是在2019年最后一季度。 自2019 年11月至12月以来，许多全科医生开始报告患有非典型双侧支气管炎的老年人和体弱者出现严重呼吸道症状的情况，在没有关于新病毒的消息的情况下，被归因于侵袭性的季节性流感。 在意大利北部两个最初封城的地区之一，对健康献血者中的SARS-CoV-2血清流行率进行了一项调查。在一组300个储存血浆样本中，2月12日到17日之间的5个样本有抗SARS-CoV-2 的中和抗体。 此外，SARS-CoV-2基因组系统发育分析第一轮COVID-19爆发的3个伦巴第患者的病毒基因组毒株共同起源可追溯到几周前。这些证据表明意大利可能存在更早期的、未被注意到的病毒传播。

    鉴于全世界症状性病例的迅速增加，更好地了解 COVID-19的最初历史和流行病学可能有助于改进筛选策略， 并遏制可能的第二波大流行的影响。 环境监测的证据表明，2019年底，SARS-CoV-2已经在意大利北部流传。对2019年10月到2020年2月份采集的意大利北部3个城市地区（ (Milan/Lombardy,  Turin/Piedmont, and Bologna/Emilia Romagna)）40份复合影响废水样本进行分子分析与PCR分析，其中12月18日在米兰和都灵的废水样本中检测出了SARS-CoV-2病毒RNA。这研究同样提示了SARS-CoV-2已经在不同地区同时传播，跟我们的结论相符。

在国际层面上，一篇文章报道了2019年12月一例法国巴黎患者因咯血住院，没有病因诊断，对储存的鼻咽拭子的回顾性分子分析证实了SARS-CoV-2感染的诊断。来自哈佛大学的研究省略若干（哈佛大学。。。这个论据。。。有点迷。。。）。

这些发现表明病毒可能在爆发时已经在多个国家传播。据我们所知，世界上任何国家都没有关于SARS- CoV-2的抗体反应的公布数据。我们的研究是在来自意大利所有地区的无症状个体的样本中进行的。在13个地区至少都检测到一个SARS-CoV-2阳性个体，伦巴第的数量最高，与国家调查的数据一致。

    第一批抗体阳性案例确定出现于2019年9月至10月间。2019年10月采集的样本在基于CPE的微中和检测中检测到了具功能性的抗SARS CoV-2中和抗体。 鉴于感染和抗体合成之间的时间延迟，这些结果表明，该病毒在官方首例确认患者之前很早就在意大利传播，甚至比中国官方报道首例病例还早。

补充说明关于检测方法
本研究使用的血清学检测是一种基于SARS CoV-2 RBD的内部设计的ELISA，即VM-IgG-RBD和VM-IgM-RBD，是一种利用病毒Spike糖蛋白(S-蛋白)受体结合位点开发的专有检测方法。S蛋白的受体结合位点RBD与人血管紧张素转换酶2(ACE2)受体之间相互作用，介导病毒与靶细胞的结合。S蛋白具有高度的免疫原性，S1亚基介导黏附结合，S2亚基介导膜融合。RBD被认为是能诱导产生中和抗体的主要的SARS-CoV2特异性靶点。

在该实验室早前发表的文章中，自研ELISA试剂盒设计是这样的：分别用多种不同浓度的重组S蛋白（包括S1，RBD）包被平板，来自不同品牌、不同稀释度的多种S1-SARS-CoV-2抗体孵育并清洗后，用HRP标记的抗IgG，IgM, IgA二抗检测，用3份NIBSC提供的康复患者血清和混合MNT和ELISA（商业化试剂盒）中的负对照人血清样本分别作为正负参照，用人IgG1 抗SARS CoV-2 S1单抗、IgM抗SARS CoV-2 S1单抗，和人IgG1 抗SARS CoV-2 RBD单抗作为质量参照，以及用对流感、白喉。百日咳病毒的超敏人血清来验证对SARS CoV-2专一性，最后选出效果最好的一种S1蛋白和一种RBD蛋白（来自义翘神州）开发自研的ELISA检测。

用自研的ELISA方法和德国产市售的Euroimmun S1 ELISA试剂盒平行分析，并加上功能性MN分析验证。最后结果表明实验室自研的VM-IgG-RBD,  VM-IgM-RBD 和 VM-IgA-RBD ELISA检测与功能性MNA分析验证一致性最高。S1 ELISA一致性不高。

基于CPE的活病毒微中和分析（CPE-based colorimetric live virus micro-neutralization assay，简称MNA）评估病人血清样本中的SARS‐CoV‐2中和抗体

血清样品在56度热失活30分钟，按不同稀释度与等体积包含100 TCID50的2019‐nCov/Italy‐INMI1野生型病毒溶液37度共同孵育1小时，各取100ul加入50%汇合度的VERO E6单层细胞，37度5%CO2培养4天，
1. CPE读数：用倒置显微镜观察细胞形态，能保护超过50%细胞不出现CPE（cytopathic effect ）的最高血清稀释度作为中和效价。
2. 显色法读数：培养3天后细胞用0.02%中性红孵育1小时并清洗，加入裂解液孵育后再540nm读数。

其中，用与SARS‐CoV‐2高度相似，同样结合ACE2受体的SARS‐CoV的IgG1单抗CR3022（据报道能高效中和SARS病毒，靶向SARS‐CoV的RBD高度保守区域）作为对照，在MN中与含100 TCID50的病毒溶液共同孵育1小时后加入到VERO E6单层细胞中，72小时培养未见任一浓度有中和活性，显示无交叉反应，即能高效中和SARS病毒的单抗在MN实验中不能中和SARS‐CoV‐2野生型毒株。用其他病毒超敏抗血清如针对腺病毒4型，流感病毒AA/H1N1/California/7/2009 (10/218), 流感B/Brisbane/60/2008 (13/312), 和流感A/Anhui/1/2013 (15/248)抗血清分别验证均无交叉反应。用Sigma -IgA/IgM/IgG人血清(S5393‐1VL)作为负对照。