“0”PCR，错误InDel的克星来了！

2019年8月23日-25日，2019全球华人遗传学大会在上海复旦大学盛大举行，华大科技产品总监蔡悦博士受大会邀请，带来了题为《更全面、准确的基因组变异检测新方案》的精彩报告，为基因组变异研究带来了全新的“0”PCR解决方案。

有人说，基因组学可以被划分为两个时代：一个没有PCR，一个有PCR。的确，没有PCR技术，就没有现代分子生物学。PCR（聚合酶链式反应）是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，拥有了扩增微量DNA的技术，DNA的测序和探索从此加快了步伐。

高通量测序的文库构建阶段 ，通过PCR将文库模版扩增数千倍，从而达到上机的文库量，以便完成后续对基因组DNA序列的测定。在测序阶段，单个DNA分子的信号难以检测，需要通过PCR扩增使单个DNA分子形成一簇，即cluster，获得足够强度的信号，测序才能够检测到。可见，对于高通量测序，文库构建和测序成簇过程的PCR，是两个关键因素。

毫不夸张的说，没有PCR，就没有高通量测序。然而，PCR可能带来这样的问题：

错：错误累积[1]
偏：扩增偏向性[2]
多余：Duplicate

PCR过程中可能引入碱基错配率可达0.06%[3]，桥式PCR扩增形成cluster这一过程的错误累积会降低DNA序列复制的保真性，影响低深度测序变异和低频突变检测的精准度和敏感度。

对于核酸模板而言，有的二级结构复杂，有的热稳定性不好，这些因素都会影响PCR扩增效率。因此，并非所有基因组序列都能在PCR扩增文库中同等体现，存在明显的偏向性，会降低基因组的覆盖度。

不同物种的GC含量不尽相同，至少有40%的基因组GC含量偏高或者偏低，例如褐潮藻类和小球藻GC含量高达65%以上。对于线虫和马来丝虫，GC含量竟然不到30%。对于这些GC含量偏高或偏低的基因组，想要很好的覆盖基因组存在一定困难。

当DNA两条链上的嘌呤嘧啶含量不平衡时会增加缺失发生的几率[4]，序列中PolyA结构、 高GC含量的序列会增加复制滑移的几率, 而复制滑移会导致序列发生插入/缺失突变[5]，而在这些区域中，PCR扩增会导致明显偏向性，引入大量易出错的InDel。

由于建库和测序的PCR扩增，会带来高达10%-25%的duplicate比率，造成DNA数据量浪费，从而增加测序成本。对于RNA来说，因为难以区分是PCR duplicates还是RNA高表达形成的相同的模板，则无法去除duplicates。这将会影响转录组表达量的准确性，尤其是小、中等表达量的转录本的准确性。

由于PCR会带来上述的各种问题，PCR从无到有再到无的过程是高通量测序技术发展的必然趋势。大会上，蔡悦博士提出来PCR-free建库+DNBSEQ™测序技术的“0”PCR测序解决方案，可以更准确、全面的检测基因组变异。

DNBSEQ™技术测序平台，测序过程中采用滚环扩增（Rolling circle amplification，RCA），只以最初的单链环状文库为模板进行线性扩增，不会有PCR过程中错误的累积，真正实现了从建库到测序的“0”PCR，还原最真实的基因组序列。以下是蔡悦博士展示的“0”PCR测序优秀的数据表现：

“0”PCR测序数据展示

DNBSEQ™“0”PCR测序，带你进入无PCR高通量测序新时代！

参考文献：

【1】Mcinerney P, Adams P, Hadi M Z. Error Rate Comparison during Polymerase Chain Reaction by DNA Polymerase.[J]. Molecular Biology International, 2014, 2014:287430.

【2】Aird D, Ross M G, Chen W S, et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries[J]. Genome Biology, 2011, 12(2):R18.

【3】Johanna B , Mattias M , Charlotte H , et al. PCR-Induced Transitions Are the Major Source of Error in Cleaned Ultra-Deep Pyrosequencing Data[J]. PLoS ONE, 2013, 8(7):e70388-.

【4】 Kondrashov A S, Rogozin I B. Context of deletions and insertions in human coding sequences[J]. Human Mutation, 2004, 23(2):177–185.

【5】 Sjödin P, Bataillon T, Schierup MH (2010) Insertion and deletion processes in recent human history. PloS ONE, 5, e8650.