BioTechniques发布优化CRISPR/Cas9实验的指南

尽管CRISPR/Cas9系统是一种强大的工具，但基因组编辑实验的实际效果会受到各种参数和生物学因素的影响。为此，比利时布鲁塞尔自由大学的研究人员在最新一期的《BioTechniques》上提出了优化CRISPR/Cas9实验的指南和工具。

在一系列的基因组编辑工具中，CRISPR/Cas9系统因简单易用而广受人们欢迎。尽管这是一种强大的工具，但基因组编辑实验的实际效果会受到各种参数和生物学因素的影响。为此，比利时布鲁塞尔自由大学的研究人员在最新一期的《BioTechniques》上提出了优化CRISPR/Cas9实验的指南和工具。

目标位点的选择

研究人员认为，认真确定目标位置是至关重要的。对于许多应用而言，功能丧失（loss-of-function）分析必不可少。常规的策略是利用sgRNA将Cas9核酸酶引导到蛋白质编码基因的N端外显子。在Cas9核酸酶的作用下，通过容易出错的非同源末端连接（NHEJ）来修复双链断裂，从而引入移码突变和提前终止密码子。

CRISPR诱导突变的高效率让基因敲除变得很轻松。然而，在靶向细胞必需的基因时，这却成了一个问题。之前，两项不同的全基因组CRISPR筛选已经确定人类基因组中大约有2000个必需基因。最近，Lenoir等人发布了一个数据库，可以从中搜索到不同人体组织中的必需基因。

因此，在研究功能丧失时，RNAi或CRISPRi已成为有效的替代研究方法，它们的效果可通过转录组水平的分析来直接评估。同时，诱导型的CRISPR工具实现了时间严格控制的基因组编辑。

作者还建议仔细评估目标区域的遗传多态性，因为它可能对CRISPR/Cas9的效果产生相当大的影响。尽管sgRNA与目标序列之间允许存在五个以内的碱基错配，但PAM及其附近序列对序列一致型有着更严格的要求。在选择sgRNA时，应当验证PAM和sgRNA结合位点是否存在SNP，因为这会影响Cas9的结合和切割。

值得注意的是，实验室中常用细胞系的DNA序列可能不完全对应于基因组数据库中的序列。在设计sgRNA之前，对目标位点进行测序可解决这一潜在的问题。细胞系倍性也是需要考虑的因素。许多癌细胞系携带四条或更多的染色体拷贝。完全敲除需要在目标基因的所有拷贝上引入突变。在产生突变克隆细胞系时，强烈建议对目标基因座进行测序，以确认纯合性敲除。

此外，染色质的状态也大大影响Cas9结合和核酸酶活性。核小体的定位直接阻碍Cas9在体内和体外的结合和切割。染色质高级结构也会影响Cas9结合和酶活。一些研究表明Cas9切割效率与开放染色质呈正相关。虽然一些基因编辑应用程序可以选择易于切割的目标，但这种做法显然不适用于基因修复及其他的治疗应用。

模式生物的基因靶向为人们带来了更多的挑战，因为染色质景观在不断变化，以确保早期发育过程中的生长和分化。作者认为，转录组图谱（RNA-Seq）和染色质开放性图谱（ATAC-Seq和ChIP-Seq）是很有用的资源，可以预测sgRNA的效率。全基因组小鼠（Brie）和人类（ Brunello）文库的发表极大地促进了小鼠和人类细胞的基因编辑。

导入方法

将CRISPR/Cas9组分导入细胞通常是利用DNA导入系统来实现的，比如将编码Cas9和sgRNA的质粒转染到细胞内。病毒颗粒的转导也是一种常用方法，往往比质粒转染更有效，适用于包括原代细胞在内的许多种细胞。

质粒转染和病毒转导分别实现了Cas9的瞬时表达和永久表达。当然，Cas9的长时间表达会导致脱靶事件的积累。因此，人们试图控制Cas9和sgRNA的表达时间，以便降低脱靶效应。研究发现，强力霉素（doxycycline）诱导的启动子可实现Cas9的瞬时表达，并且与慢病毒载体兼容。

若担心质粒整合的问题，可以使用Cas9/sgRNA核糖核蛋白（RNP）复合物来实现基因编辑。Cas9 RNP复合物可自行制备，或从各个供应商处购买。RNP复合物的导入方法也有很多种，比如脂质体转染、电穿孔、显微注射等。对于植物细胞而言，用基因枪导入Cas9 RNP复合物或编码Cas9和sgRNA的质粒似乎是一种不错的方法。

研究发现，RNP复合物在导入12至24小时内切割染色体DNA，而基因编辑的频率在1天后到达平台期。若采用质粒来表达Cas9和sgRNA，在导入3天后才能达到相同的基因编辑水平。此外，Cas9蛋白在24至48小时内迅速降解，而质粒可连续表达几天。因此，RNP复合物的使用可减少脱靶效应。

RNP复合物的另一个优点是适用于各种模式生物和细胞类型。研究发现，对体内环境而言，Cas9/sgRNA RNP复合物的功能优于其他导入方法。以斑马鱼研究为例，人们将编码Cas9的mRNA或Cas9蛋白连同sgRNA一起显微注射到受精胚胎中进行诱变。与编码Cas9的mRNA相比，RNP复合物在显微注射后立即起作用。若是导入mRNA，还要考虑密码子优化的问题。

在利用慢病毒或质粒导入Cas9和sgRNA时，通常利用抗性标记（潮霉素或嘌呤霉素）或报告基因（GFP）来分离成功转导或转染的细胞。在转染RNP复合物时可使用替代报告基因（surrogate reporter）。荧光形式的Cas9（比如Cas9-GFP或Cas9-Cy3）可用来分选RNP转染的细胞。

向导RNA的效率和特异性

对于同一基因而言，不同sgRNA的表现也许千差万别。目前有许多生物信息学工具可用来设计sgRNA，其中一些工具可对sgRNA进行打分。不过，没有一种工具可以保证sgRNA的效果，因此在可能的情况下，尽量测试多个sgRNA，并利用核酸内切酶切割实验来鉴定sgRNA在体外的切割效果。当然，这不能保证体内有效性，因为还取决于染色质开放性。

Cas9的靶向特异性取决于20 nt的sgRNA向导序列以及基因组中与目标序列相邻的PAM的存在。值得注意的是，将sgRNA向导序列缩短至17 nt，可明显提高靶向特异性。许多在线工具可以辅助sgRNA的设计，但预测效果和实际效果往往有很大差异，因为光凭序列同源性不能完全预测脱靶位点。

理论上来说，对编辑前后的细胞进行全基因组测序（WGS）分析可无偏向地检测脱靶。不过，WGS本身也面临挑战，可能不适用于脱靶突变的检测。尽管测序成本不断下降，但人们需要一定程度的生物信息学知识来检测小的插入缺失，并将信号和噪声区分开。此外，克隆扩增期间也可能出现许多自发的新突变，无法与脱靶效应区分。

为了克服这些限制，人们最近开发了几种方法来检测基因组中Cas9的脱靶活性，比如BLESS（标记DSB后富集和测序）、HTGTS（高通量的全基因组易位测序）、GUIDE-Seq（通过测序实现全基因组内DSB的无偏向鉴定）、Digenome-Seq（体外Cas9消化的WGS）、IDLV（利用整合酶缺陷型慢病毒载体检测脱靶）以及最近的SITE-Seq（鉴定DNA切割位点的生化方法）和CIRCLE-Seq（体外鉴定脱靶突变的方法）等。

染色质免疫沉淀（ChIP）是研究蛋白质-DNA相互作用的首选技术。因此，您可以通过ChIP-qPCR来评估dCas9在目标区域的特异性富集，同时还可以将这种方法扩展到ChIP-Seq，实现无偏向的脱靶位点分析。作者认为，基于dCas9的ChIP-PCR/Seq是一种强大的方法，能够快速经济地评估几条sgRNA。不过，没有一种方法能保证完全覆盖脱靶位点，因此理想的方案是结合使用多种方法。

展望未来

作者认为，若要将Cas9应用于基因治疗，必须要解决几个问题。首先，Cas9核酸酶通常来源于常见的人类病原体。最近的报道称人群对SpCas9和SaCas9已经有免疫力。如何控制Cas9引起的免疫应答，这是一个问题。其次，另一个限制是Cas9比较大，无法包装到腺相关病毒载体中，可以考虑Cas9核酸酶家族的其他成员，比如Cas12a（Cpf1）。此外，Cas13a和CasRx也为基于RNA编辑的新疗法铺平了道路。
（生物通 薄荷）

原文检索

Guidelines for optimized gene knockout using CRISPR/Cas9

BIOTECHNIQUES VOL. 66, NO. 6 REVIEW