杨辉课题组再发一篇《Nature》：DNA碱基编辑诱导大量靶外RNA突变

　　

6月10日《Nature》杂志报道了中国科学院神经科学研究所杨辉课题组与中国科学院计算生物学研究所和四川大学合作完成的一项研究，证实了DNA碱基编辑器会造成数以万计个非靶向RNA单核苷酸变异（SNVs），这些非靶向SNVs可通过在脱氨酶中引入点突变来加以消除。

这项研究揭示了DNA碱基编辑的一个潜藏风险，还通过工程脱氨酶提供了一个解决问题的方法。

今年，美国麻省总医院的Keith Joung团队和哈佛大学David Liu团队分别在《Nature》和《Science Advances》杂志报道了DNA单碱基编辑器存在大量RNA脱靶，通过突变版本的BE3和ABE可以部分降低RNA的非靶向编辑。

DNA碱基编辑能够在不产生任何双链断裂（DSBs）的情况下对基因组DNA进行直接点突变校正，但潜在的脱靶效应限制了它的应用。腺相关病毒（AAV）是最常见的DNA编辑基因治疗呈递系统。由于这些病毒能够长期维持体内基因表达，因此DNA碱基编辑诱导的潜在RNA靶外效应对其临床应用具有重要意义。

之前的几项研究已经评估过DNA碱基编辑的基因组DNA非靶向突变。同时，研究表明与常用DNA碱基编辑器整合的脱氨酶经常表现出RNA结合活性。例如，在胞嘧啶碱基编辑（CBEs）中使用的胞嘧啶脱氨酶APOBEC1被发现可以打靶DNA和RNA，在腺嘌呤碱基编辑（ABEs）中使用的腺嘌呤脱氨酶TadA被发现会诱导RNA上位点特异性肌苷形成。然而，任何由DNA碱基编辑器引起的潜在RNA突变都没有被很好地评估。

为了在RNA水平上评价DNA碱基编辑的脱靶效应，研究人员计算了CBE或ABE处理细胞中每一个被复制的靶外RNA SNVs，并探讨了通过DNA碱基编辑的工程脱氨酶消除靶外RNA SNVs的可能性。

他们将一种类型的CBEs，BE3（APOBEC1 -nCas9-UGI），或一种类型的ABEs，ABE7.10（TadA -TadA*-nCas9），连同GFP和/或无向导RNA（sgRNA）一起转染到HEK293T培养细胞中。在这些HEK293T细胞中，通过BE3和ABE7.10验证了DNA编辑的高靶向效率后，他们对这些样品进行了平均深度为125X的RNA测序，并定量评估了每个复制中的RNA SNVs。

CBE或ABE处理细胞的每次复制都进行靶向编辑效率评估以确保有效编辑，然后将CBE和ABE处理组的非靶向RNA SNVs数量与GFP对照组进行比较。结果发现在DNA碱基编辑处理的细胞中，RNA SNVs的数量显著增加。

此外，研究人员发现，BE3或ABE7.10处理细胞的突变偏向分别与APOBEC1或TadA的相同，表明靶外效应是由DNA碱基编辑的过度表达引起的。他们还鉴定了这些非靶向RNA SNVs的CBE和ABE特异性基序和遗传区域。

为了消除碱基编辑的RNA非靶向活性，课题组研究了在APOBEC1或TadA上引入点突变的效果。三个高保真变体BE3W90Y+R126E、BE3（hA3AR128A）和BE3（hA3AY130F），将RNA靶外SNVs降低到了基础水平。同样，ABE变体ABE7.10F148A也显示出了靶外效应的完全消除。

本研究通过在脱氨酶中引入点突变，获得了CBEs和ABEs的更高保真变体，并提出了一种利用合理工程提高基础编辑特异性的方法。

杨辉，1985年生，2003-2007年就读于上海交通大学生命科学学院，获生物技术学士学位。2007-2012年就读于中科院上海分院生化细胞所李劲松研究组，获发育生物学博士学位。2012-2013年在麻省理工Whitehead 研究所 Rudolf Jaenisch 研究组从事博士后研究工作。2014年起任中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所研究员，灵长类疾病模型研究组组长。2010年以来发表了近30篇SCI论文，其中包括以第一作者或通讯作者身份发表的3篇《Cell》、2篇《Nature》和1篇《Science》。

免费提供威斯腾CRIPR/Cas9基因编辑技术答疑及相关资料！

原文检索：Zhou, C., Sun, Y.,  Yan, R., Liu, Y.,  Zuo, E.,  Gu, C., Han, L., Wei, Y., Hu, X.,  Zeng, R., Li, Y.*, Zhou, H.*, Guo, F.*, Yang, H. *(2019）Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature

（生物通：伍松）