细胞&基因治疗？其实是载体治疗！

无论是什么药物在人体中起作用都分两步：delivery和function。我们所说的细胞＆基因治疗更加需要精准的delivery和强大的function。如何将目的基因或者细胞安全有效地传送到人体内成为细胞和基因治疗第一个要突破的重要瓶颈。今天我们就来简单总结一下各个重要载体的异同。

病毒和非病毒载体

目前的基因&细胞治疗主要采用病毒和非病毒两种载体形式。根据数据统计，使用非病毒载体进行临床实验的项目大约占目前基因&细胞治疗总数量的36.6%；其主要载体形式有质粒和脂质体等。而大部分的基因&细胞治疗项目都是采用病毒作为载体形式。

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图1：1989-2017年间临床实验中所用到的各种载体的个数及占比。（图片来源：The Journal of Gene Medicine）

非病毒载体

脂质体：

1987年，Felger首先使用脂质体作为载体介导基因进入细胞。脂质体一般带有极性疏水基团，该基团能够保证脂质体分散在水介质中形成双层脂质结构，同时将氨基酸基团暴露于水介质中。脂双层结构与细胞的双层膜结构类似，有利于脂质体复合物经过细胞吞噬作用进入细胞。第一个被批准作用于人体的脂质体是DC-Chol/DOPE。大多数应用于基因治疗的脂质体都是阳离子脂质体。其优点是自身带有的正电荷更有利于通过胞吞作用进入细胞，可以在近端肿瘤组织中高表达。但是由于脂质体本身代谢时间较快，很难表达在远端肿瘤细胞中。同时，有研究指出阳离子脂质体具有细胞毒性，因此其在基因/细胞治疗中的安全性也应重点考虑。

裸质粒：

使用裸质粒作为载体是基因治疗常用的手段之一。截止到2017年，全球范围内使用裸质粒作为载体的基因治疗临床试验共有442个。与病毒载体相比，裸质粒在安全性上更有优势，比如其免疫原性、毒性更低，同时不存在基因整合的风险。另外，质粒的生产、运输和储存的成本也较低，更有利于商业化生产开发。但是由于质粒本身的顺转体系问题，其稳定性远不如病毒载体体系，从而制约了质粒作为载体的有效性。

病毒载体

图2：近年来，使用慢病毒及腺相关病毒的进行基因/细胞治疗的比例大幅上升。（数据来源：clinical trials）

逆转录病毒：

逆转录病毒是单链RNA病毒，在宿主细胞内直接被当做mRNA合成早期蛋白，同时依赖RNA聚合酶合成双链，再转录成后来的致病mRNA。由于逆转录病毒能够随机插入宿主细胞基因组并稳定整合，它被广泛用于基因治疗中，并取得很大的成功。但其缺点也很明显。由于其倾向于插入基因第一个内含子和转录起始位点，它相对慢病毒更容易引起插入性随机突变。在1997年，伦敦医生尝试用逆转录病毒，莫罗尼小鼠白血病病毒，治疗X染色体上的IL2RG基因突变缺陷导致的X连锁重症联合免疫缺陷症（SCID-X1），然而，由于其插入和破坏的基因变成了人类基因LMO2(LIM domain only 2)导致基因的异常激活，从而引发数例白血病。这次的事件也与1999年腺病毒治疗Jesse Gelsinger导致死亡的事件一齐成为基因治疗历史上的两大事故。这两起悲剧无时无刻不提示人们对于病毒载体安全性的思考和关注。

慢病毒：

相比之下，慢病毒因无严重的临床事故出现成为目前最安全的病毒载体选择之一。慢病毒属于逆转录病毒科，但拥有比γ-逆转录病毒更为复杂的基因组。来源上来说，慢病毒分为人免疫缺陷病毒（HIV-1），猴免疫缺陷病毒（SIV）和马传染性贫血病毒（EIAV）三种。目前使用较多的是来源于HIV的慢病毒载体。慢病毒载体具有能感染非分裂期细胞、容纳外源性目的基因片段大、稳定性强、免疫原性小等特点。大量研究表明，相对其他病毒载体，慢病毒感染效率高，更容易感染一些较难感染的组织和细胞，其效率一般可以达到30%-95%以上。相比于腺病毒以及腺相关病毒，慢病毒容量更大，能携带更大、更复杂的基因组，并且具有整合转基因到宿主基因组的能力使产物稳定和长期的表达。

目前我们使用的慢病毒载体包装系统将gag、pol基因与rev或env基因分别构建在不同的质粒上，并且在病毒基因组的3'LTR引入缺失以产生自失活（SIN）慢病毒载体，破坏LTR的启动子/增强子活性，进一步提高了安全性，并降低致癌风险。

所以，对于目前的基因/细胞治疗来说，慢病毒通常是首选的载体之一。尤其是在CAR-T治疗领域，慢病毒的应用非常普及，远远多于其他载体。

腺相关病毒：

腺相关病毒（AAV）作为最安全的病毒载体之一也是最早用于基因治疗的病毒载体。2016年2月，AAV载体制造之父，宾夕法尼亚州大学基因治疗研究所的James Wilson 教授利用AAV治疗罕见代谢尿素循环系统障碍。该病是由鸟氨酸转氨甲酰酶（OTC）缺失导致的。当该酶系中一种酶丢失或者缺陷，氨就会积累在血液中，循环至大脑，最终严重损伤大脑。据报道每40000名出生婴儿中就有一名患有OTC的缺失。James Wilson团队用AAV8血清型载体将作为剪切工具的核酸酶Cas9特异性导入肝细胞中。另一个载体将gRNA带到特异性DNA靶位点，从而达到定点突变。

AAV作为基因治疗非常重要的载体之一，是目前唯一一个NIH评级为RG1的病毒载体，迄今从未发现野生型AAV致病；重组AAV去除了野生型AAV基因组的96%，进一步保证了安全性；由于AAV不插入基因组，因而没有致癌性；其本身的免疫原性又基本不会引起免疫排斥，相对其他病毒优势非常明显。但同时，由于AAV的包装容量过小，对基因大小限制较多，其应用场景有限。而且，使用AAV作为载体的基因治疗需要消耗大量的病毒，并可能需要多次注射，如何降低生产成本也成为目前各方关注的焦点。

除了以上两种主流病毒之外，在基因治疗领域，腺病毒、溶瘤病毒也都有其一席之地，因篇幅所限，在这里我们不展开讨论。下一篇文章，我们将介绍使用病毒载体进行基因治疗时需要重点关注的质量指标，欢迎关注！

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