效果堪比粉碎机，两名华人学者发现CRISPR新工具

CRISPR-Cas9就像一把小剪刀，允许研究人员在特定的位置剪断和编辑DNA链。不过，有时候这把小剪刀的力量实在太弱了。于是，研究人员又开发出一种新型的CRISPR工具，能够删除长片段的DNA。

密歇根大学领导的研究团队近日在《Molecular Cell》杂志上介绍了这种堪比粉碎机的工具——I型CRISPR-Cas3。他们首次在人类细胞中实现了长距离的DNA删除。这种工具适用于遗传学研究，有助于人们了解疾病的基础，并治疗与长链DNA相关的疾病。

文章的两名通讯作者分别是密歇根大学生物化学系的助理教授张燕（Yan Zhang）博士和康奈尔大学分子生物学与遗传学系的教授柯爱龙（Ailong Ke）博士。张燕博士解释说，这种新工具使用了另外一种CRISPR系统，与目前广泛使用的CRISPR系统不同。不过这两者都来自细菌，正常功能是清除入侵的DNA。

与众不同的CRISPR

新工具使用的是I型CRISPR，对细菌而言它其实比II型CRISPR（含有Cas9）更常见。I型CRISPR之前从未用于任何真核细胞，它采用一种称为Cascade的核糖蛋白复合物来寻找其靶点，并利用Cas3酶来粉碎DNA。

柯爱龙教授领导的团队完成了颇具挑战性的蛋白质优化和纯化方面的工作。他主要用结构和生物化学的方法研究了I型CRISPR系统。

两个研究团队尝试将细菌的CRISPR组分导入人胚胎干细胞和HAP1细胞系。他们发现，在向导RNA的带领下，I型CRISPR系统成功删除了靶向的DNA区域，大小从几百bp到100 kb不等。

带有马达的粉碎机

张燕博士将Cascade-Cas3系统称为“带有马达的DNA粉碎机”，因为它可以沿着DNA链移动一段距离，在移动的同时降解遗传物质。

“Cas9是一种分子剪刀，可以到达特定的位置并剪断DNA，”张燕博士谈道。“不过，Cas3则可以到达你想要的地方，沿着染色体移动，删除几十kb的片段。这使其成为一种强大的筛选工具，可以确定哪些DNA区域对特定疾病最重要。”

当人们研究不编码任何蛋白质的长链非编码RNA时，这种工具可能特别有用。利用DNA粉碎机，人们可以删除一大段DNA，然后看看会发生什么。

此外，Cas3能够沿着染色体移动一段距离，这是目前的Cas9技术无法实现的。而且，无核酸酶活性的Cas3版本（dCas3）也能沿着DNA移动，但缺乏粉碎机的功能，这为长距离的表观基因组改造提供了一个强大的平台。

克服重重挑战

为了让干细胞显示是否有DNA被删除，墨尔本大学的Sara Howden博士开发出一种灵敏的双报告细胞系，而之前的“报告”干细胞大多不够灵敏，如果粉碎活性比较低的话。

团队面临的另一项挑战是如何利用新一代测序来确定粉碎机粉碎了哪些DNA。密歇根大学的Zhonggang Hou博士开发了一种基于转座酶的方法，而Peter Freddolino博士建立了定制的信息学管道来分析深度测序的结果。

研究人员指出，CRISPR-Cas3系统使用的向导RNA序列比CRISPR-Cas9的更长，而且目标搜索和降解是两个完全分离的步骤，因此这种方法更容易得到控制。它不大可能在人们不想要的地方做出错误的切割。

张燕博士推测，这种新工具及其衍生物也许对疾病治疗有用，不过或许在多年后才能实现。目前，密歇根大学和康奈尔大学已就这一工具申请了一项联合专利。（生物通 薄荷）

原文检索

Introducing a Spectrum of Long-Range Genomic Deletions in Human Embryonic Stem Cells Using Type I CRISPR-Cas

Molecular Cell Available online 8 April 2019