近期大热的单细胞核测序技术

不知不觉地，生物实验的规模正在逐渐变小，而通量正在逐渐变大。以往那些庞大的仪器正被手持设备或硅制芯片所取代，试剂的单位从毫升转变为微升或纳升；而重复数量也从两三个变为96孔、384孔甚至1536孔。因此，实验重点也从生物体转换到组织再到细胞和细胞器，包括细胞核。

从2011年开始，有关单细胞核测序的论文开始出现。通过谷歌学术检索，第一篇相关论文是2011年的一项肿瘤进化研究，同年晚些时候还有一篇苔藓基因靶向分析的研究发表。2012年，它被用于肿瘤的拷贝数变异分析。

近两年，单细胞核测序领域开始迅猛发展。2018年，仅仅单核RNA-seq（snRNA-seq）就有160多篇论文发表。这是一种相对较新的方法，分析的是细胞核，而不是完整的细胞。它能够对难以分离的细胞开展基因表达分析。

snRNA-seq采用微流体技术，将带有条形码的微珠和单个细胞核一起装入微小的液滴内。这些液滴作为纳升级的反应管，实现了成千上万个细胞核分离和建库，从而大幅降低了建库的成本。

在有些情况下，细胞是很难完整分离的，比如长期保存的组织，或者大脑细胞和脂肪细胞。在分离细胞时所用的酶和破坏力往往会影响其他细胞区室的内容。此时，单核RNA测序就显得特别重要。

单核RNA测序有哪些优势？

根据我们的直觉，处理细胞比处理细胞核要简单得多。从细胞中获取细胞核至少需要两个步骤：裂解和离心。人们通常利用去垢剂裂解细胞，并用Dounce匀浆器均质化。之后通过流式细胞仪或梯度离心法纯化出细胞核。

然而，单细胞测序的准备过程往往是造成实验可变性的主要因素。如何获得足质足量的单细胞悬液，这是人们面临的第一个难题，特别是那些稀有细胞或难以解离的细胞。

对各种组织而言，细胞外基质组分不同，这使得单细胞制备的方式也有所不同。人们需要对细胞解离的操作方案进行个性化的优化。

样品制备过程涉及到组织收集、研磨/均质化、酶促解离以及稀有细胞的富集。每一步都可能影响RNA含量，也不能准确地反映细胞类型的真实比例。解离操作往往使样品偏向于一种或几种细胞，从而错过其他更值得关注的细胞。

于是，科学家和生产商开始引入一些工具和方法，希望尽量减少单细胞研究中的偏倚。加州大学欧文分校的一个研究团队开发出一种微流体装置，这一装置利用流动限制来产生高剪切力的区域，从而将细胞与基质分离开，使其适用于单细胞分析。美天旎也提供gentleMACS组织处理器及各类组织解离试剂盒，能够高效、稳定地处理各类样本，获得高活力的单细胞悬液。

哪种方法更好：细胞还是细胞核？

人们不禁会问，细胞核转录组是否代表了整个细胞的转录组，以及在snRNA-seq中发现的基因是否或多或少与特定研究相关。一些比较单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单核RNA测序的研究表明，转录本在整个细胞和细胞核中的表达程度相当。

华盛顿大学（圣路易斯）的一个研究小组最近将单细胞测序（DropSeq）与单细胞核测序（sNuc-DropSeq）进行比较。他们研究的对象是纤维化成年小鼠肾脏。通过分析DropSeq获得的11,000个转录组，研究人员发现肾小球细胞不存在，并且另一组细胞似乎经历了解离诱导的应激。相比之下，单核RNA测序揭示了肾细胞的完整多样性。

这些研究人员的结论是，尽管在细胞类型覆盖度方面具有可比性，但单核RNA测序的优势在于“减少了解离偏倚，与冷冻样品兼容，避免了解离引起的转录应激反应以及在纤维化肾脏上有着出色的表现”。

单核RNA测序技术

2017年，Broad研究所张锋和Aviv Regev领导的团队开发出一种名为DroNc-Seq的单细胞核测序方法。它受到Drop-Seq方法的启发，融合sNuc-Seq和微流体技术，能够对大脑等复杂组织进行大规模的并行分析。

DroNc-Seq方法消除了解离偏倚的问题，适用于固定组织或不容易解离的细胞。同时，与sNuc-Seq相比，它的实验规模大大扩大，可加速表达谱分析，并降低实验成本。在此基础上，Dolomite Bio公司开发出了Nadia高通量单细胞建库仪。

此外，加州大学圣地亚哥分校的张鹍教授团队也在2017年开发出基于微流体的单核RNA测序技术——snDrop-seq。这种技术攻克了在微滴中有效裂解核膜而不引起RNA过度降解的难题，可以对成千上万个单细胞同时进行转录组分析，还可用来评估新鲜和冻存组织的特异性表达谱，有助于研究组织的功能异质性。

单核RNA测序通过揭示复杂肿瘤的细胞类型、状态、遗传多样性和相互作用，拓宽了单细胞研究的能力，特别是长期保存或冷冻保存的样品。它克服了解离偏倚的问题，也适用于结构复杂的组织。不过，细胞核的mRNA含量要低得多，而细胞核与细胞RNA表达是否重叠，这也是研究机构一直在解决的问题。